[发明专利]PiggyBac转座子介导的肌肉特异表达A-FABP通用载体构建

说明书

技术领域

本发明属于基因工程或转基因动物研究技术领域，涉及载体的构建，特别是一种高整合效率、高富集效率的PiggyBac转座子介导的肌肉特异表达A-FABP通用载体的构建，适用于基因功能研究及转基因动物制备。

背景技术

研究证实，牛肉中肌内脂肪含量是影响牛肉品质的一个重要因素，肌内脂肪含量低将严重降低牛肉品质。肌内脂肪含量与甘油三脂的沉积密切相关，调节甘油三酯在动物体内不同位置的沉积是调节肌内脂肪含量的先决条件。随着生物技术的发展研究发现，甘油三酯在动物体内的代谢和运输与脂肪酸结合蛋白（FABPs）的关联性很大，尤其是脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因(A-FABP)，将A-FABP基因转入到哺乳动物细胞中能够加快甘油三酯的聚集（Kralisch S，StePan H，et al.Serum levels of adipocyte fatty acid Binding Protein are increased in gestational diabetes mellitus.Eur J Endocrinol,2009）。然而A-FABP基因只在脂肪组织中高表达，在肌肉细胞中表达很少，朱丹丹等人筛选了牛的骨骼肌特异性启动子α-actin，通过α-actin启动子特异性启动A-FABP基因在肌细胞中的表达，可以极大地提高肌内脂肪含量，具有重要的现实意义。

PiggyBac转座子具有转座活性高，负载量大，并且能长期稳定的表达等优点，能够用于转基因动物的研究。2005年，丁昇首次将PiggyBac转座子应用于人和小鼠的基因功能研究，实现了人和小鼠细胞株中高效导入外源基因并稳定表达，并且培育出了带荧光的转基因小鼠（Ding S，Wu X，et al.Efficient transposition of the piggyBac（PB）transposon in mammalian cells and mice.Cell，2005）。该研究证明PiggyBac转座子能够在哺乳动物中实现高效转座以及用于基因功能研究和转基因动物制备成为可能，并在很大程度上可以提高转基因动物的成功率；同时，PiggyBac转座子在基因组中TTAA位点特异识别并重组整合的特性，在一定程度上克服了传统转基因研究中随机整合所存在的外源基因受位置效应影响等而表达量低、干扰临近基因表达等的不足，这将在今后转基因研究中具有重要应用前景。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种转基因牛的PiggyBac转座子通用型、高富集效率载体的构建方法，该载体可用于研究基因功能或制备生产转基因牛。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种PiggyBac转座子介导的肌肉特异表达A-FABP通用型载体的构建方法，其特征在于，通过全基因合成PiggyBac转座子载体转座所发生转座必需的PB5'碱基序列和PB3'碱基序列，并在两序列中间引入多克隆位点FseI、MluI、PacI、NotI、HindIII、BamHI、BstBI和AscI；在商业化质粒pSP72基础上完成PiggyBac转座子骨架载体构建；再将LoxP锚定的新霉素抗性基因（Neomycin/NEO）和绿色荧光蛋白基因（EGFP）以及α-肌动蛋白启动子（α-actin promoter）和牛A-FABP基因克隆到多克隆位点FseI、MluI、PacI、NotI、HindIII、BamHI、BstBI和AscI中，最终构建完成PiggyBac-NEO-EGFP-actin-AFABP通用型表达载体。

所述PB5’端和PB3’端碱基序列为：

PB5’端碱基序列：

CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCTTGAA

ATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGG

ACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGC

GGTAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATG

ACGCATGATTATCTTTTACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATT

ATATTGTTATTTCATGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTC

TTGTTATAGATATCGTGACTAATATAATAAAATGGGTAGTTCTTTAGAC