[发明专利]山羊葡萄糖转运载体4基因及其重组表达载体和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及山羊葡萄糖转运载体4基因及其重组表达载体和应用。 

背景技术

葡萄糖是一种极性分子，需要借助于胞膜上的运载蛋白进入细胞内。在哺乳类细胞内有两类葡萄糖转运载体：Na⁺葡萄糖协同转运蛋白和易化葡萄糖转运蛋白(Glut)。参与人体葡萄糖转运的主要的是易化葡萄糖转运蛋白。至今在哺乳类动物体内已发现13种Glut，其中Glut4是一个主要的研究热点。 

由于葡萄糖是乳腺上皮细胞合成乳糖的主要前体，所以给泌乳动物的乳腺提供葡萄糖是新陈代谢的重点。因为乳糖维持着乳的渗透压，所以乳糖合成速率是影响产奶量的主要原因。另外，葡萄糖除了是重要的乳糖合成前体，还可以产生ATP、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，也是合成蛋白质、脂肪和核苷酸的前体。一头泌乳牛每产1kg牛奶需要72g葡萄糖。因此，一头日产奶量40kg的奶牛，它的乳腺每天需要摄入3kg的葡萄糖。事实如此，乳腺摄入的葡萄糖是血糖总量的60～85％。 

Glut4是胰岛素依赖型蛋白，主要存在于胰岛素敏感的组织中：骨骼肌，心肌和脂肪组织，Glut4是这些组织中的主要的葡萄糖运载体。近年来由于葡萄糖钳夹技术的应用，已经证实细胞外膜上葡萄糖载体的含量与细胞葡萄糖最大转运能力呈正相关关系，葡萄糖跨膜转运是骨骼肌利用葡萄糖的主要限速过程。基础状态和胰岛素刺激状态下，葡萄糖利用分别占全身的20％和70％～85％。Glut4在促进葡萄糖的吸收和利用上起了关键限速的作用。尤其是在胰岛素状态下，Glut4起决定性作用。 

通过增加细胞GLUT4的表达，可以达到促进细胞吸收葡萄糖，增加细胞能量代谢和合成代谢的目的。 

本发明提供了山羊葡萄糖转运载体4基因GLUT4序列及其相应的氨基酸序列。提供了含有山羊葡萄糖转运载体4基因的真核表达载体pCDNA3.1-GLUT4和含有这种载体的大肠杆菌(E.coli)细胞JMI09/pCDNA3.1-GLUT4以及稳定转染的山羊乳腺上皮细胞株GMGE/pCDNA3.1-GLUT4。利用本发明成果，可以用于构建转基因整合载体，提高山羊乳腺对葡萄糖的摄取能力，增加产奶量。 

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种山羊葡萄糖转运载体4基因。 

本发明的另一目的是提供含有该基因的重组表达载体。 

本发明的又一目的是提供该基因的应用。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现： 

一种葡萄糖转运载体基因GLUT1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

所述的基因GLUT4，该基因的编码序列如序列表SEQ ID NO：1中第144-1673位所示核昔酸。 

含有本发明所述的GLUT4基因的真核表达载体pCDNA3.1-GLUT4。 

含有真核表达载体pCDNA3.1-GLUT4的大肠杆菌(E.coli)受体细胞JM109/pCDNA3.1-GLUT4。 

本发明所述真核表达载体pCDNA3.1-GLUT4稳定转染的山羊乳腺上皮细胞株GMGE/pCDNA3.1-GLUT4。 

本发明所述的葡萄糖转运载体基因GLUT4在提高哺乳动物乳腺细胞葡萄糖吸收和/或乳糖合成中的应用。 

本发明所述的真核表达载体pCDNA3.1-GLUT4在提高哺乳动物乳腺细胞葡萄糖吸收和/或乳糖合成中的应用。 

有益效果 

葡萄糖转运载体基因可以提高山羊乳腺上皮细胞的葡萄糖的吸收和乳糖的合成。体外转染山羊乳腺上皮细胞的荧光定量PCR结果显示，稳定转染组（只转染pCDNA3.1-GLUT4）的GLUT4表达量高于对照组（正常培养的山羊乳腺上皮细胞）接近55倍。通过测定培养24h和48h的培养基中葡萄糖的含量，24h转染组葡萄糖的吸收量达到1.990±0.0141μg/μg蛋白，显著高于对照组的1.771±0.00346μg/μg蛋白；48h转染组葡萄糖的吸收量达到9.287±0.278μg/μg蛋白，极显著的高于对照组细胞（1.99±0.014μg/μg蛋白）。48h转染组乳糖合成量达到178.679±32.968ng/μg蛋白显著高于对照组细胞(49.926±4.192ng/μg蛋白)。 

附图说明

图1：真核表达载体pCDNA3.1-GLUT4的质粒图谱