[发明专利]一种基于活细胞矩阵技术的物质毒性的确定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种应用于快速确定物质毒性和其致毒机理的新方法，更具体的说是一种用于纯化合物或复杂环境介质样品的毒性预测致毒机理的高通量筛选方法。 

背景技术

关于从分子水平研究化合物致毒机理的研究，目前已经被大量实验验证的致毒机理有：一氧化碳与血红蛋白的紧密结合，使其失去输氧能力而致毒；汞等重金属毒物会与酶活性中心的巯基结合，抑制酶的活性而致毒。还有实验验证，一些环境有毒污染物的致癌、致畸和致突变作用与它们能改变或损伤机体的DNA的结构和相应功能有密切关系。例如亚硝胺改变DNA的结构和转录功能，会造成染色体的突变而致癌；多环芳烃、芳香胺和芳香族偶氮化合物由于会引起DNA损伤，使细胞生长繁殖失控，从而形成肿瘤。然而，从宏观上全方位的评价一个化合物或环境毒物的致毒机理，仅仅掌握这些信息是远远不够的。 

大肠埃希氏菌，又称大肠杆菌，作为一种通常用来揭示某种具有某种普遍规律的生命现象的模式生物，有研究者绘制其体内的染色体蓝图，并对其体内大部分基因的功能进行了推断和实验验证，这就为基于毒理生物个体从宏观上对环境毒物的致毒机理进行判断提供了一种可能。随后，在Nature Method有文章刊出，Alon Zaslaver等人进一步对大肠杆菌体内2000多个不同的、涵盖大部分基因的启动子进行标记，每一个启动子均由低拷贝质粒表达而来，这就使得大肠杆菌体内高精度基因表达数据的获得提供一个便利的手段。目前，采用该技术相关研究报道，大多数仅限于某种或者某一类具有特定功能的基因。 

通过检索发现国内外文献没有关于采用全基因组对环境毒物进行毒性的确定和致毒机理评价的报道。 

发明内容

1．发明目的：针对现有的对环境毒物进行毒性的确定方法的完整性和准确度的缺乏，本发明提供一种基于大肠杆菌全基因组活细胞芯片技术的评价方法，通过本发明可以对环境毒物的细胞毒性和致毒机理进行高通量测试全基因组测试。 

2．技术方案： 

本发明的技术方案如下：

一种基于高通量筛选技术和大肠杆菌全基因组的环境毒物致毒机理评价方法，其包括以下步骤：

(1)      首先，测试环境毒物对大肠杆菌的生长抑制作用，在96孔板内接种相同密度的大肠杆菌，当细菌吸光度OD600值达到0.1时，根据细菌对环境毒物的耐受性，加入具有一定剂量的环境毒物，并绘制S型曲线，求算环境毒物对细菌生长抑制的EC20；

(2)      取出冻存于-80摄氏度的存有大肠杆菌的96孔板母板（共21块，大肠杆菌基因库购自Thermo Scientific公司），在室温下放置至其融化，迅速用复制触角将其转移复制入一块装有新鲜培养基的96孔板新板，培养细菌约3个小时，将其分装入384孔板，此时，板孔内吸光度OD600应该在0.1左右；

(3)      选择0、0.01*EC20、0.1*EC20和EC20作为4个测试浓度，在384孔板内快速加入受试环境毒物；

(4)      将加过受试化合物的384孔板放入酶标仪，记录其荧光读数在4个小时内的变化情况。

本发明步骤（1）中的96孔板，由Corning（NY，USA）公司提供，货号：CLS3599。 

步骤（2）中的384孔板由NUNC（NY, USA）公司提供，货号：142761。 

步骤（3）中酶标仪由BioTek（Winooski，VT）公司提供。 

有益效果： 

本发明基于高通量筛选技术，采用荧光标记的大肠杆菌作为模式生物，提供了一种涵盖大肠杆菌体内大部分基因的环境毒物致毒机理评价方法。它一方面具有基因芯片技术的研究效果，为研究者提供高品质的基因表达数据；同时该技术更快捷、简便，无需复杂的前处理过程；并且，该技术具有很高的可重复性；成本低，可以最大程度的避免人为操作误差或干扰。

同时，该技术在污染毒物筛选中，不仅可以考虑到化合物的可利用性，同时可以兼顾多化合物的复合毒性，以便可以对生物样品的潜在毒性有一个更加全面的分析；它采用更敏感的基因表达变化作为指标，它结束了许久以来仅仅依靠细菌生长抑制、生存这些简单生理指标来判断化合物毒性的现状；它所标记的每一个菌种所标记的基因均代表一种致毒通道，这对于判断化合物的致毒机理提供了大量的信息。