[发明专利]检测大豆抗原蛋白血清抗体的间接ELISA方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测大豆抗原蛋白血清抗体的间接ELISA方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

大豆是动物养殖中应用最广泛的一种优质植物蛋白源，不仅蛋白质含量高，价格低廉，而且必需氨基酸的绝对含量高，且氨基酸的组成比例平衡。但是，大豆中存在的致敏因子能引发人和动物，尤其是婴幼儿和幼龄动物的过敏反应，从而导致腹泻和消化吸收障碍，甚至死亡，造成了重大损失，限制了其在生产上的应用。研究表明，引起动物发生过敏反应的主要致敏因子是大豆抗原蛋白，而大豆球蛋白(glycinin)和β-伴大豆球蛋白 (β-conglycinin)又是大豆抗原蛋白中的主要抗原成分。按离心沉降系数和免疫学方法又把大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白分别称为11S蛋白和7S蛋白，二者约占到大豆蛋白的70%。目前，大多研究使用膨化、热乙醇变性法、热加工法等处理方法，使致敏因子变性失活；或通过改善酶的作用条件，优化酶制剂的组合，利用外源酶对大豆抗原蛋白进行酶解从而去除抗原蛋白；或使用蛋白质糖基化工程对蛋白质表面的糖链进行改造，来改良蛋白质性质；或利用基因敲除的方法使某些基因无法表达，从而消除大豆中的致敏因子。这些方法不能完全去除致敏物质，而且去除条件要求高，成本增加，虽然有新品种培育出，但需要复杂的食品安全评估过程和农业推广问题，导致其无法在生产实践中得到广泛应用。目前，国内外主要采用饲料中抗原检测的方法来除去由大豆抗原蛋白引起的食源性过敏问题。这种方法只能作为一种预防手段，不能对已经过敏的动物进行有效的辨别和诊断，延误病情，不能及时除去过敏原，导致动物病情加重，造成重大经济损失。因此实现从动物体的过敏反应出发，探索出一种可以对大豆抗原蛋白过敏反应动物的鉴别和诊断方法具有现实意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种检测仔猪大豆抗原蛋白血清抗体的间接ELISA方法，为人和动物大豆球蛋白过敏性疾病的防治和发病情况的掌握提供一种快速、简便的检测方法。

本发明是通过以下技术方案来实现的。

一种检测大豆抗原蛋白血清抗体的间接ELISA方法：

是以经纯化的大豆抗原蛋白作为抗原包被，用以检测大豆抗原蛋白血清抗体的间接ELISA方法。

进一步地，上述大豆抗原蛋白包括大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白。

进一步地，上述纯化步骤包括：

将大豆抗原蛋白溶于PH为7.4的磷酸盐缓冲液，再使用Sepharose CL-6B凝胶过滤，用磷酸盐缓冲液洗脱得到的洗脱液经透析，冷冻干燥得大豆抗原蛋白，储存于-20℃作为抗原备用。

进一步地，上述间接ELISA方法包括：包被抗原、封闭、加样、加酶标二抗、显色、终止。

进一步地，上述间接ELISA方法的工作条件为：抗原包被为2.0~10.0μg /L，封闭液为1%BSA，样品稀释浓度为1：400~1：3200，酶标二抗稀释浓度为1:1000~1:3000，显色液AB比例为等比，阴阳临界值为0.225~0.032。

本发明的有益效果：

建立的检测仔猪大豆球蛋白抗体的间接ELISA方法，该方法对大豆抗原蛋白引起的人和动物过敏性疾病有较强的敏感性和特异性，为这类疾病的诊断提供依据，有助于解决我国动物的大豆蛋白源性食物过敏问题，为这类疾病的疾病学调查提供有效的技术手段，为人和动物大豆抗原蛋白过敏性疾病的防治和发病情况的掌握提供一种快速、简便的检测方法。

附图说明

图1为大豆球蛋白(11S蛋白)的蛋白洗脱峰数据说明图；

图2为大豆球蛋白(11S蛋白)的电泳分析数据说明图；

图3为β-伴大豆球蛋白(7S蛋白)的蛋白洗脱峰数据说明图；

图4为β-伴大豆球蛋白(7S蛋白)的电泳分析数据说明图。

具体实施方式

下面根据实施例和附图说明对本发明作进一步详细说明。

实施案例1：

本发明提供的间接ELISA方法，其中，以大豆球蛋白(11S蛋白)为检测抗原：

（1）抗原的纯化及纯度分析

纯化：将11S蛋白溶于pH为7.4的磷酸盐缓冲液，Sepharose CL-6B凝胶过滤(l.6×120 cm层析柱)，用磷酸盐缓冲液洗脱得到的洗脱液经透析，冷冻干燥得大豆球蛋白(即11S蛋白)，储存于-20℃作为抗原备用。其中图1为大豆球蛋白(11S蛋白)的蛋白洗脱峰数据说明图，纯化数据可参照图1。