[发明专利]一种RNA的预备模板PCR检测方法

权利要求书

1.一种RNA的预备模板PCR检测方法，所述方法包括：

（1）设计与目标RNA上任意一段序列互补的长度为25~40mer的单链寡核苷酸DNA，记为探针A；探针A的GC含量为40~60%，解链温度为70~85℃；将探针A锚定在PCR管内，得到锚定PCR管；

（2）设计部分序列与目标RNA上另一段任意序列互补的单链寡核苷酸DNA，其结构为: 两端是特异的长度为20~30mer的PCR引物序列、中间为与目标RNA互补的长度为25~40mer的序列，记为探针B；探针B 的GC含量为40~60%，解链温度为70~85℃，与探针A和目标RNA的结合区域互不重叠；

（3）取待测样本，加入探针B和含表面活性剂的细胞裂解液，反复吸打，转移至离心管中，冰上放置20min，4℃离心，取上清液，得到裂解上清液；

（4）取裂解上清液20uL至锚定PCR管中，60~70℃保温5~15min，吸干管内液体，以洗涤液洗涤3~9次，吸干，加入20uL 由PCR缓冲液和PCR引物配制的PCR反应液，进行PCR扩增，扩增产物进行荧光定量分析；

（5）以空白裂解液作为阴性对照，按照步骤（1）和（2）方法进行处理和分析，以样本Ct值小于空白裂解液Ct值判断为阳性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述裂解液组成如下：1% SDS，500mmol/L NaCl，2mmol/L MgCl₂，10mmol/L 2-巯基乙醇，0.1mg/ml 鱼精DNA，0.1% Tween20，1% 脱脂奶粉，溶剂为10mmol/L、pH7.5的Tris-HCl。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR缓冲液组成如下：50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，0.2mmol/L dNTP，5% DMSO，0.05% Tween20，0.4×SYBR Green I，0.5U/20ul Taq酶，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述洗涤液为TBST缓冲液。