[发明专利]烟草抗番茄黄化曲叶病毒的体细胞无性系突变体的离体筛选方法

权利要求书

1. 烟草抗番茄黄化曲叶病毒的体细胞无性系突变体的离体筛选方法， 其步骤包括：

1) 以含有番茄黄化曲叶病毒TYLCV侵染性克隆的农杆菌转化烟草叶片； 

2) 转化后的烟草叶片通过长时间的组织培养诱发体细胞无性系突变体；

3) 突变体植株及其后代植株接种携带TYLCV的烟粉虱连续筛选，获得表型正常、无病症的抗TYLCV烟草。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

1) 取普通烟草(Nicotiana tabacum )叶片，经消毒后剪成0.5-2cm²大小，以OD₆₀₀=0.3-0.4的含有番茄黄化曲叶病毒侵染性克隆PTYj01的农杆菌浸泡10 min，置于MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA共培养基上、25℃黑暗培养2天；

2) 叶片置于MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA +500mg/L头孢霉素+50mg/L卡那霉素选择培养基上、25℃、16h/8 h光照周期培养，每隔20天继代一次，连续继代3-4个月；

3) 将愈伤组织上长出的1- 2 cm新芽切下，转入1/2 MS +500mg/L头孢霉素生根培养基上生根培养；

4) 表型正常的再生苗经TYLCV特异引物进行PCR鉴定为阳性后，移栽温室内，每株接种50头携带TYLCV的烟粉虱，整个生育期都不体现病症的植株收获自交种子；

5) 自交种子播种于温室内再经携带TYLCV的烟粉虱取食，选择整个生育期都不体现病症的植株。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

TYLCV特异引物为：

5'-CGCCCGTCTCGAAGGTTC-3'

5'-GCCATATACAATAACAAGGC-3'；

PCR鉴定方法为：

94℃预变性4 min， 94℃变性30s， 58℃退火45s， 72℃延伸1 min，共30个循环，最后72℃下延伸10 min，取10μL PCR产物在质量百分比为1%琼脂糖胶上进行电泳检测，结果显示能扩增出600bp大小的TYLCV DNA特异片段的再生植株即为转基因植株。