[发明专利]一种端粒酶的AETCA检测试剂盒及检测方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种端粒酶的锚定延伸端粒序列互补扩增（Anchored-Extension and Telomeric Complements Amplification，AETCA）检测试剂盒及检测方法。

（二）背景技术

端粒酶（telomerase）是一种特殊的逆转录酶，是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白（RNP）复合物， 包含3个主要成分：端粒酶RNA（hTR）模板，端粒酶催化亚单位（hTERT）和 端粒酶相关蛋白（hTLP）。hTR是端粒酶进行延伸反应的模板，约有450个碱基，其中包含5'-CUAACCCUAAC-3'的模板序列， hTERT是端粒酶逆转录酶的蛋白催化亚基， hTLP是端粒酶的调节单位。端粒酶的主要功能是利用染色体末端（端粒）的3'末端为引物，以自身RNA为模板合成端粒-TTAGGG-重复序列添加到染色体末端，从而维持端粒原有长度，使端粒的稳定和保护染色体的功能得以延续，细胞因逃逸渐进性衰老而达到“永生化”。在一些特定的组织细胞，如：生殖细胞、胚胎细胞、造血干细胞、外周血淋巴细胞、毛发、皮肤、子宫内膜等分裂旺盛的组织细胞中有低水平的活化端粒酶的表达， 但在正常成熟的体细胞中则没有端粒酶活性， 细胞因为端粒的逐渐缩短而导致衰老和死亡。极少数体细胞可能偶然通过激活端粒酶而逃逸程序性老化，其生存延长可能给另外的基因损伤的积累提供机会，导致进行性肿瘤性发展， 即癌变， 因此，端粒酶的重新激活是体细胞向肿瘤细胞转化， 即癌变的关键步骤。对大量的临床标本的检测表明，绝大多数的肿瘤细胞都呈端粒酶阳性（>85%），而在癌旁组织和正常组织的端粒酶阳性率很低（<5%），因此， 端粒酶是一个被广泛接受的特异性很高的肿瘤标志物.端粒酶的检测则可能发展成为对癌症进行检测和分子诊断的有力手段.端粒酶检测的标本来源可以是培养细胞，手术摘除组织，针吸活检组织，胸水，腹水，膀胱或胰管冲洗液，棉拭子所取分泌物， 痰液， 尿液等。早期采用超声等物理破碎的方法在不同细胞中的提取效率差异较大，此后采用去污剂（如CHAPS）裂解的方法在少量细胞获取了较稳定的端粒酶提取液：40～100mg冷冻（-70℃）组织或10⁴～10⁶沉淀细胞用冰预冷的洗液[10mmol/L hepes-KOH（pH7.5）， 1.5mmol/L MgCl2， 10mmol/L KCI， 1mmol/L DTT]洗1次，10000g4℃离心1min，沉淀加200μl冷裂解液[10mmol/L tris-HCI（pH7.5）， 1mmol/L MgC12，1mmol/L EGTA， 0.1mmol/L PMSF， 5mmol/L β-巯基乙醇，0.5％CHAPS，10％甘油]，自动匀浆器冰浴中匀浆，450rpm，25min， 16000g4℃离心20min，移取上清160μl，部分样品用于蛋白定量，其余迅速冷冻，-70℃保存。端粒酶经小于10次冻融可保持活性稳定。对某些标本可以用0.5％Tween-20代替0.5％CHAPS。

现有端粒酶活性检测方法有三类: 1.传统的端粒酶活性PCR检测方法: 端粒重复序列扩增方法 （Telomeric Repeats Amplification Protocol， TRAP） 及衍生方法； 2. 非TRAP类的PCR检测方法: （premature termination of telomeric extension-PCR， PTEP）； 3. 非PCR类的检测方法.

传统的TRAP法需要进行繁琐的聚丙烯酰胺凝胶电泳及染色步骤。此后， 虽然许多学者又进行了改进，尤其是内标的引入使得借助某些分析仪可以进行较精确的半定量测定，但这些改进只是在PCR后的检测手段上的，采用的TRAP-PCR核心反应是相同，因而无法改善TRAP法的如下固有缺陷:

（1）扩增效率低。因为TRAP法是直接以端粒酶的延伸反应的产物做PCR的模板，得到的PCR产物是从几十bp到几百bp的大小不等的一系列条带，扩增产物的不确定性导致扩增效率受到了很大限制，因而降低了灵敏度；

（2）特异性的问题。TRAP扩增产物的不确定性所衍生的问题是结果分析容易收到非特异PCR扩增的干扰；

（3）可重复性/稳定性不好。因为TRAP法是直接将细胞裂解液加入到PCR体系中的，而细胞裂解液往往含有很多抑制PCR反应的成分，所以很容易导致整个检测的失败；