[发明专利]一种植物组织透射电镜样品的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备植物组织细胞样品的方法，特别是涉及一种在电子显微镜下观察植物组织细胞的样品的制备方法，属于农业科学技术领域。

背景技术

近年来，随着农、林业经济的不断发展，研究植物资源的内容也越来越深入，利用透射电镜掌握大量的植物组织细胞内部结构信息，已经成为科学工作者保护森林资源和人类生态环境的重要理论依据。但因植物组织的细胞壁厚，结构致密，药液渗透不够充分，因此难以制备出高分辨的透射电镜样品，从而限制了透射电镜在植物研究中的应用。

传统的植物组织透射电镜样品制备时，采用乙醇或丙酮脱水后直接利用不同比例的树脂和乙醇或丙酮混合溶液在常压下进行渗透，然后放入纯包埋剂中渗透数小时或过夜，再进行包埋。这种传统的方法包埋幼嫩的植物组织，如根尖、叶、芽组织后，切片效果还较为理想，但是当这种传统的包埋方法用于高度木质化的茎、枝条时，由于茎、枝条的组织结构致密，往往造成树脂难以完全渗透。在切片时出现样品受到玻璃刀或者钻石刀的挤压发生形变，甚至破裂，引起植物组织碎裂，制成的切片出现皱褶，搓板样震颤以及无法切下厚度适中的连续切片，切片遇水碎裂散开，最终影响样品透射电镜图片的质量。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种植物组织透射电子显微镜样品的制备方法，本发明方法制备的样品中Spurr树脂完全渗透到植物组织细胞中，Spurr树脂充满整个植物组织细胞，样品切片中组织细胞的微细结构信息保留完整，有效的降低了污染物对样品观察的影响，增加了样品的清晰度，而且避免了切片过程中出现的样品形变，切片皱褶，搓板样震颤以及无法切下厚度适中的连续切片等问题。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种植物组织透射电镜样品的制备方法，包括在真空状态下对样品进行Spurr树脂的渗透处理。

其中，所述真空状态的绝对压力低于0.09MPa；所述Spurr树脂中二氧化乙烯基环己烯（ERL4221）、聚丙二醇二缩水甘油醚（DER736）、壬烯基丁二酸（NSA）、二甲基胺基乙醇（DMAE）的重量份配比为10：8-9：24-26：0.4-0.6，优选为10：8-8.5：26：0.5。

特别是，所述的渗透处理是将植物样品依次置于Spurr树脂与环氧丙烷混合溶液、Spurr树脂进行渗透处理，使Spurr树脂完全渗入植物样品细胞中。

其中，所述Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液中Spurr树脂与环氧丙烷的体积之比为1-3:1.

特别是，所述渗透处理是采用Spurr树脂与环氧丙烷的体积之比依次为：1:1、2:1、3:1的Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液、Spurr树脂进行渗透处理，使Spurr树脂完全渗入植物样品细胞中。

特别是，采用体积之比为1:1的Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液进行渗透处理时的绝对压力为0.07-0.09MPa，优选为0.08MPa；渗透时间为8-16h，优选为12h；采用体积之比为2:1的Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液进行渗透处理时的绝对压力为0.05-0.06MPa，优选为0.06MPa；渗透时间为8-16h，优选为12h；采用体积之比为3:1的Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液进行渗透处理时的绝对压力为0.03-0.04MPa，优选为0.04MPa；渗透时间为8-16h，优选为12h；采用Spurr树脂进行渗透处理时的绝对压力≤0.02MPa，优选为0.01MPa；渗透时间为20-30h，优选为24h，即采用Spurr树脂渗透时间为20-30h，优选为24h。

特别是，还包括用环氧丙烷对植物组织样品进行浸泡，使环氧丙烷充满植物组织。

本发明另一方面提供一种植物组织透射电镜样品的制备方法，其特征是包括如下顺序进行的步骤：

1）软化处理

将植物样品于沸水中煮制处理后置于超纯水中进行浸泡，重复煮制和浸泡直至植物样品沉入水底，制得软化植物组织；

2）脱水处理

将软化植物组织置于体积百分比浓度为30-100%的乙醇溶液中浸泡，脱除植物组织中的水分，制得乙醇植物组织；

3）置换处理

将乙醇植物组织依次置于环氧丙烷与乙醇的混合溶液、环氧丙烷中，浸泡、脱出乙醇，直至环氧丙烷完全置换出乙醇，制得环氧丙烷植物组织；

4）渗透处理

将环氧丙烷植物组织依次置于Spurr树脂和环氧丙烷混合溶液、Spurr树脂中浸泡，进行渗透处理，Spurr树脂渗透到植物组织细胞中，制得树脂渗透植物组织；