[发明专利]一种新型高分辨定量多色荧光原位杂交方法及其应用

权利要求书

1.一种定量多基因荧光原位杂交方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)、探针制作：在常用的数据库如NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser和UCSC Genome Bioinformatics上定位检索含检测目的基因的BAC(Bacterial artificial chromosomes)克隆，获得目的基因的克隆后，大量提取DNA，再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP连接到酶切好的DNA上，沉淀DNA，用含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解探针；

2)杂交：将要检测的标本处理好后，加入步骤1)制作好的探针，加上盖玻片，用封片胶封片，放入杂交仪，变性后杂交过夜；

3)洗片，荧光显微镜检：标本杂交过夜后，去除盖玻片，放入核酸杂交的缓冲液(Saline Sodium Phosphate EDTA，SSPE)中洗涤两次，梯度乙醇中脱水后晾干，用DAPI复染，在荧光显微镜下观察检测结果；

4)图像采集与分析：

采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型，六种滤光片采用Chroma公司分别为：DAPI(SP-100)，Spectrum Green^TM(MF101)，Cy3^TM v1(SP-102)，Texas Red(SP-107)和Zeiss公司Cy5(50)，PF-415(45)组合，首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用计算机自动荧光视野重定位法(AxioVision Rel.4.8.2软件)记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD(Charge-Coupled Device，电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在六种滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得清晰、稳定，理想的多色图像；

5)检测基因个数n为1≤n≤5时，采用上述步骤1)-4)即可完成检测分析，当检测基因个数n为5＜n≤10，需对第一次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，当10＜n≤15，需对第二次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，当15＜n≤20，需对第三次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，每次杂交试验设计的检测基因个数最多为5个，当检测基因个数n为5＜n≤10，原探针洗脱和新探针重杂交步骤如下：

第一次杂交实验图像采集后，切片存放于冷室以备下次重杂交使用，重杂交的新探针准备同步骤1)，制得新探针，备用；切片移去盖玻片，置于2×SSC中洗涤，每张切片滴加150μl的70％甲酰胺，70℃变性3分钟，迅速置于-20℃预冷的70％乙醇，洗去陈旧的探针，梯度乙醇中脱水，每张切片滴加10μl新探针，杂交、洗片同步骤2)、3)标本重杂交后图像采集：切片置于多色荧光显微镜下观察，采用计算机自动荧光视野重定位法(AxioVision Rel.4.8.2软件)使显微镜自动进入第一次图像采集位置，然后同时对DAPI，Spectrum Green^TM，Cy3^TM v1，Texas Red，Cy5，PF-415六个滤光片通路中的荧光信息进行采集，因此，对于每张切片所有探针杂交完毕后所采集图像均在同一视野，可同时对同一细胞进行多基因分析。

2.根据权利要求1所述一种定量多基因荧光原位杂交方法，其特征在于：所述定量多基因荧光原位杂交方法适用于对同一细胞进行5-20种基因分析。