[发明专利]靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的建立方法

权利要求书

1.重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1）、设计靶向基因shRNA：

ORF6-6e：

5'-gatccGCCATAGAAACCTGGAAGTTTCAAGAGAACTTCCAGGTTTCTATGGCTTTTTTg-----3'

3'-----gCGGTATCTTTGGACCTTCAAAGTTCTCTTGAAGGTCCAAAGATACCGAAAAAActtaa-5'；

2）、构建重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA：

通过PCR扩增zsGFP和NEO片段，将ORF6-6e 所述的shRNA酶切（EcoRI-BamHI

）连接到pMD18-T Simple载体上，并通过BglII-EcoRV酶切，回收、连接到PXL-BAC2载体上， 构建了重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA。

2.靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的构建方法，其特征在于：设计能有效阻止猪蓝耳病病毒增殖和复制的靶向基因shRNA，并通过转座子载体插入供体细胞的基因组，从而获得能有效阻止蓝耳病病毒感染的克隆细胞系。

3.根据权利要求2所述的转基因细胞系的构建方法，其特征在于：利用重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA进行细胞转染，包括以下步骤：

将重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA用lipofectin2000转染试剂转染Marc-145细胞；

到细胞增长接近汇合时按1：10密度传代，继续培养；培养基为含有10%胎牛血清的DMEM基本培养基；

待细胞密度增至50％～70％汇合时，加入G418浓度为1200μg/ml的筛选培养基，每3~5天更换一次G418浓度为1200μg/ml的筛选培养基；当有超过80%的细胞死亡时，改用G418浓度为600μg/ml的筛选培养基维持筛选，每3~5天更换一次G418浓度为600μg/ml的筛选培养基，筛选10～14天后，有抗性的克隆细胞出现，改用含有10%胎牛血清的DMEM基本培养基进行培养，待克隆细胞逐渐增大后，将克隆细胞经胰酶消化后利用有限稀释法筛选阳性细胞单克隆；从而获得靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系；

上述培养和筛选的条件均为：于37℃，5% CO₂培养箱中培养；

G418浓度为1200μg/ml的筛选培养基的制备方法为：培养基中加入G418直至G418的浓度为1200μg/ml，该培养基为含有10%胎牛血清的DMEM基本培养基；

G418浓度为600μg/ml的筛选培养基的制备方法为：培养基中加入G418直至G418的浓度为600μg/ml，该培养基为含有10%胎牛血清的DMEM基本培养基。

4.根据权利要求2或3所述方法构建而得的靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的用途，其特征是：对PRRSV型病毒具有抑制作用。