[发明专利]一种细胞灭活疫苗、卵黄抗体及卵黄抗体的注射液和冻干粉

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞灭活疫苗、卵黄抗体及卵黄抗体的注射液和冻干粉，属于疾病免疫领域。

背景技术

猪圆环病毒2型（PVC2）是断奶仔猪多系统衰竭综合症和肾病皮炎综合症的主要病原，同时该病还会造成免疫抑制，容易造成其他疾病的继发或并发感染，具有高发生率、高流行性、高致病性、高死亡性等特点，给养猪业造成了巨大的经济损失。PVC2的致病机制尚不清楚，其对猪免疫系统的破坏被认为是引起相关猪病的主要原因。由于免疫力下降，猪在应激和病原感染时容易遭受其他病原侵袭，其临床症状主要为进行性消瘦、贫血和黄疸。现在防治手段有抗病毒药、中药等，但效果不佳。

鸡卵黄抗体IgY是鸡的一种免疫球蛋白Ig，鸡IgY在功能上相当于哺乳动物IgG，但结构上有所不同，具有典型的的免疫球蛋白的空间构象。鸡卵黄抗体具有很多优越性：（1）由于鸟类与哺乳类动物种系发生学的差距，鸟类更适于生产抗哺乳动物抗原的特异性抗体。卵黄抗体不会激发补体系统，不与抗哺乳动物抗原的抗体发生反应，不与哺乳动物和细菌的Fc受体结合，这在免疫诊断中具有重要意义。（2）卵黄抗体作为一种具有生物活性的免疫球蛋白，在贮存、生产、加工、摄食及消化过程中保证其稳定性是非常关键的。多项试验表明，鸡IgY具有较好的稳定性，耐酸、耐碱、耐热。卵黄抗体较易保存，4℃条件下存放5年或室温条件下存放6个月对抗体活性无明显影响。（3）卵黄抗体量大，成本低，便于规模化生产。卵黄中抗体浓度能长期维持在相当于甚至超过血清抗体浓度的水平上。1只产蛋鸡（以平均每周产蛋5~6枚，平均每枚鸡蛋蛋黄大约15mL计算）所产蛋生产的抗体量相当于90~100mL血清或180~200mL血液中抗体的量，例如1只兔子1个月可提取IgG约200mg，而1个月1只蛋鸡可从蛋中提取IgY2000mg以上。此外，在实际生产中，动物的采血不仅对动物本身是极大的应激，而且费时、费工，大规模生产是不切实际的，而利用蛋鸡生产抗体要方便的多。总的来讲，卵黄抗体对动物没有毒副作用，用高免卵黄抗体治疗动物疾病不但避免了高免血清价格昂贵、产量低的缺点，而且可以避免高免血清在治疗过程中引起的副作用，是一种很有前途的新型免疫球蛋白制剂。目前卵黄抗体的制备及生产工艺已经成熟，可以保质保量的生产，卵黄抗体在禽畜疾病诊断、治疗和预防的应用越来越多。但是，目前抗猪圆环病毒2型疫苗的治疗比较单一，而且卵黄抗体制备方法繁琐，抗体的损失较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种细胞灭活疫苗。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案提供一种细胞灭活疫苗，由以下方法制备获得：

1）取病料制成匀浆，反复冻融后以10000-12000rpm离心15-20min，取上清液，过滤，接种敏感单层PK-15细胞；

2）将PK-15细胞连续传代，细胞冻融，提取PCV2病毒的DNA，针对PCV2病毒ORF1基因，由具有序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核苷酸序列以及SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的核苷酸序列组成的两对特异性PCR引物对目的基因扩增；

3）扩增产物克隆入PMD-18T载体进行测序，鉴定；

4）筛选多个具有抗原免疫活性的病毒表位，经过特异引物PCR、产物电泳、测序、克隆、纯化、检测每个表位的蛋白免疫活性，选择5个抗原表位点；

5）将5个抗原表位点连接，插入到鹅圆环病毒标准毒株基因中，然后病毒在敏感性细胞PK-15单层上传代，获得免疫原性的毒株；

6）扩大增殖，用IPMA法测定病毒效价；

7）当病毒在PK-15细胞中传代表现稳定细胞病变出现规律，种毒的毒价稳定在10^3.9TCID₅₀/1.0ml，收集细胞，甲醛灭活加弗式佐剂制得细胞灭活疫苗。

所述的步骤1）中细胞反复冻融3次。

所述的步骤1）中过滤采用0.22μm滤膜。

所述的步骤2）中PK-15细胞连续传代6代，步骤5）病毒在细胞PK-15单层上传代45代。

本发明的目的还在于提供一种细胞灭活疫苗制备的卵黄抗体。

本发明的技术方案还在于提供一种细胞灭活疫苗制备的卵黄抗体，由以下方法制备获得：

1）用细菌灭活疫苗，每间隔7-10天对健康产蛋鸡群进行基础免疫、加强免疫和强化免疫三次免疫，加强免疫后开始检测抗体效价，当猪圆环病毒抗体效价达1：64、鹅圆环病毒抗体效价达1：64以上时，收集高免蛋；

2）清理、消毒高免蛋，晾干，无菌术取卵黄，得到卵黄原液；