[发明专利]一种表达抗凝血酶III的重组羊胎儿成纤维细胞

说明书

技术领域

本发明属于转基因克隆细胞技术领域，具体涉及一种表达抗凝血酶III的重组羊胎儿成纤维细胞。

背景技术

抗凝血酶III（antithrombinIII，简称ATIII）属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，是人体血浆中的一种重要的抗凝血因子，它在血浆中承担着60%～70%的抗凝血活性，在维持血液生理性凝血与抗凝血中起着重要的作用。抗凝血酶III的合成场所为肝脏，其主要通过与凝血酶Xa及XIa结合等方式灭活凝血酶，从而发挥抗凝血的作用。抗凝血酶III在人体中含量减少常见于以下病例：

a）遗传性抗凝血酶III缺乏；

b）获得性抗凝血酶III缺乏，见于肝硬化、肝癌晚期等各种肝脏疾病；

c）抗凝血酶III丢失增多，见于肾脏疾病；

d）抗凝血酶III消耗增多，见于各种原因造成的血液凝固性增高；

e）由抗凝血酶III先天或后天缺乏导致血栓的形成而引起的脑血栓或心肌梗塞等疾病。

目前人抗凝血酶III蛋白多来自于人类血浆提取，随着市场需求的不断扩增以及血浆原料的不断萎缩，血浆来源的人抗凝血酶III逐渐呈现出供不应求的态势。鉴于此种情况，利用重组DNA技术在体外高效表达与天然蛋白结构功能均类似的重组蛋白替代品便成为了解决血浆蛋白供不应求的不二之选。

已有报道的重组人抗凝血酶III蛋白表达体系包括酵母、CHO细胞及转基因动物等。其中美国GTC生物治疗公司的显微注射法转基因胚胎所培育的山羊乳腺生物反应器表达体系所生产达到重组人抗凝血酶III蛋白表达量最高，其结构与功能最接近天然蛋白。但是，GTC公司所制作的转基因细胞系（胚胎），由于随机整合等因素，难以保持外源基因的稳定遗传，一般外源基因会随细胞系传代或转基因动物繁育而逐渐丢失，不利于优良转基因形状的保持及目的蛋白的高效表达。因此，如何获得一种能够高效表达目的蛋白且外源基因可以随之稳定遗传的细胞系，成为了动物生物反应器制药行业一项亟待解决的难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达抗凝血酶III的重组羊胎儿成纤维细胞，即一种作为核供体细胞的包含rhATIII乳腺特异性表达载体的奶山羊胎儿成纤维细胞系，为制作高质量的rhATIII转基因奶山羊反应器提供坚实的基础，从而弥补现有技术的不足之处。

本发明的表达抗凝血酶III的转hATIII基因成纤维细胞SMlsCh-AT已于2012年8月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C 2012103 。

本发明的重组羊胎儿成纤维细胞的制备方法，是将携带有整合了人的抗凝血酶III蛋白基因的表达载体转染入羊胎儿成纤维细胞内，再筛选出目的基因rhATIII已整合到基因组上的山羊胎儿成纤维细胞。

本发明的重组羊胎儿成纤维细胞在制备奶山羊生物反应器中的应用。

本发明通过构建的rhATIII乳腺特异性表达载体，使目的基因rhATIII整合到羊胎儿成纤维细胞的基因组上。通过在rhATIII基因两端克隆山羊β酪蛋白基因的5’和3’调控区，山羊β酪蛋白基因的5’和3’调控区可以指导目的基因在山羊乳腺组织中特异的高效表达。而且，本发明使用基因打靶技术，使含有目的基因rhATIII的特异性表达载体可以定点整合至山羊胎儿成纤维细胞基因组中，避免了由于随机整合而对目的基因表达带来的不确定性，使目的基因rhATIII的表达效率更高。本发明的包含目的基因rhATIII的山羊胎儿成纤维细胞可作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞，通过体细胞核移植法获得转基因克隆胚，将所得胚胎移入受体羊的子宫即可高效率生产出转rhATIII基因的奶山羊生物反应器。

具体实施方式

本发明首先是构建携带有抗凝血酶III（ATIII）基因的重组表达载体,载体构建方法可以参照申请号为2011102521955的专利说明书中的描述来进行，其具体步骤如下：

1、包含目的基因rhATIII的重组载体构建

从人类肝脏组织中提取总RNA，以oligo(dT)为引物合成cDNA第一链。以合成的cDNA第一链为模板，根据已公开的ATIII基因序列（GenBank，D29832）设计PCR引物，并在引物5’端引入一个唯一的Xho1酶切位点，进行PCR扩增，将PCR产物克隆至pUC19载体上，通过DNA测序分析确定载体所包含的ATIII序列与已公开ATIII序列一致。

上述的ATIII基因序列也可以根据GenBank中记录的序列人工合成。

2、重组基因打靶表达载体的构建