[发明专利]一种高效表达枯草芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的方法

说明书

技术领域

一种高效表达枯草芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的方法，本发明属于酶基因工程和酶工程领域。具体地说涉及一种L-天冬酰胺酶基因工程菌及其构建方法。

技术背景

L-天冬酰胺酶(EC 3.5.1.1)是一种有抗癌活性的蛋白酶，能专一催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和NH₃。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表现为对某些肿瘤的抑制作用，尤其对急性白血病和恶性淋巴肿瘤有效。L-天冬酰胺酶已成为治疗白血病非常有效的药物，对骨髓没有抑制作用。

L-天冬酰胺酶可以减少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中的还原糖和天冬酰胺在高温加热过程中通过美拉德反应生成，在食物中加入天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺，从源头上减少丙烯酰胺的生成。

从1953年Kidd观察到豚鼠血清有破坏Gardner癌细胞的作用，1961年Broom证实豚鼠血清中的抗肿瘤因子为L-天冬酰胺酶，1964年Mashburn等从Escherichia coli中部分提纯了L-天冬酰胺酶，并证实这种酶也有抗肿瘤因子的作用，2004年Amrein等提出用L-天冬酰胺酶代替其他方法减少食物中丙烯酰胺含量，2009年Hendriksen等研究证明在高温处理食品时加入L-天冬酰胺酶不会产生危害，同时有众多学者通过具体的实验证明L-天冬酰胺酶可以降低炸土豆片、马铃薯干粉、面团等食物中丙烯酰胺的含量。这些研究不仅证明了L-天冬酰胺酶具有抗癌效果，同时也为临床研究和大量生产创造了条件。

一些微生物、哺乳动物及植物被证实含有L-天冬酰胺酶。因为动物血清中L-天冬酰胺酶含量低，且提取工艺复杂，微生物具有易培养，成本低等优点，成为学者研究的重点，目前研究的产L-天冬酰胺酶微生物主要包括Escherichia coli、Erwinia carotovora、Erwinia chrysanthemi等，但野生菌株L-天冬酰胺酶产量低，近年来利用基因工程技术将L-天冬酰胺酶基因克隆到大肠杆菌中，获得L-天冬酰胺酶的高效表达，利用工程菌产L-天冬酰胺酶已成为一个重要来源。

L-天冬酰胺酶有两种类型，L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II，Escherichia coli、Erwinia chrysanthemi、B.subtilis等均包含这两种L-天冬酰胺酶，研究证实仅L-天冬酰胺酶II具有抗癌作用，来自Escherichia coli和Erwinia chrysanthemi的L-天冬酰胺酶II已被开发为治疗急性淋巴细胞白血病的有效药物，目前研究的大部分是具有抗肿瘤效果的L-天冬酰胺酶II。

本发明通过表达载体pMA5，实现了B.subtilis 6-7L-天冬酰胺酶II(简称ansZ)的高效表达。枯草芽孢杆菌作为安全稳定的工业生产菌株，培.养条件简单，发酵周期短，成为微生物产L-天冬酰胺酶的潜在菌株。

发明内容

本发明所使用菌种为B.subtilis 6-7，该菌株前期用于发酵葡萄糖合成2，3-丁二醇，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CTCCM 2009200。

本发明的主要研究内容：本发明利用分子技术克隆了来自B.subtilis 6-7的L-天冬酰胺酶基因(简称ansZ)，构建重组表达载体pMA5-ansZ，并将其转化B.subtilis168，成功构建了基因工程菌pMA5-ansZ/B.Subtilis168。对构建的基因工程菌进行酶活测定，发现重组菌的酶活为22.4U/mL，出发菌株酶活仅为0.039U/mL，重组菌酶活较出发菌提高了574倍。

本发明采取的技术方案：

一种L-天冬酰胺酶基因工程菌，是将出发菌株B.subtilis 6-7L-天冬酰胺酶基因连接在表达载体pMA5上，并转化B.subtilis168得到的工程菌株。

重组菌株构建方法

(1)L-天冬酰胺酶引物设计

根据NCBI枯草芽孢杆菌全基因组核酸序列中ansZ基因序列，设计L-天冬酰胺酶基因的PCR引物P1和P2。

P1：5’-GAC GGA TCC ATG AAA AAA CAA CGA ATG CT-3’(BamH I)

P2：5’-GGC ACG CGT TTAATA CTC ATT GAAATAAG-3’(Mlu I)

(2)重组表达载体pMA5-ansZ的构建