[发明专利]一种人脐静脉内皮细胞HUVEC的分离培养及传代方法

说明书

一、技术领域

本发明为一种人脐静脉内皮细胞HUVEC的分离、培养与传代方法，属于生物技术领域。

二、背景技术

血管内皮细胞具有多种生理功能，能产生和分泌许多生物活性物质，在维持血管舒缩，抗凝血等方面起重要作用。体外血管内皮细胞的成功培养是研究内皮细胞功能及其在各种疾病发生发展中所起作用的基础。从健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带分离得到的人体脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)是广泛用于实验研究的血管内皮细胞。

人脐静脉内皮细胞体外生长能力较差，原代培养不易成功。以往主要是采用机械分离法和组织块移植法。将脐静脉剪开，用手术刀背等刮取内皮细胞或使用带有尼龙筛的分离管，但这一方法很难掌握力度，用力太轻，取得的细胞数量很少；用力太重，易混杂其他血管壁细胞如成纤维细胞等，而且此方法易损伤内皮细胞。近几年来人脐静脉内皮细胞分离已逐渐被酶消化法取代，此法获得的细胞较纯，且能较好地保持其生物活性。从保持细胞活性和结构完整性来看，胶原酶被认为是最理想的血管内皮细胞分离酶，对细胞间质有较强的消化作用，能使上皮细胞与胶原组织成功分离，且不损伤内皮细胞，分离出的血管内皮细胞数量多，杂细胞污染少，且细胞贴壁能力强。

人体其它部位的血管内皮细胞来源困难，本发明采用新鲜的健康产妇新生儿脐带，采用胶原酶I型用消化分离得到脐静脉内皮原代细胞，经济实用，简便易行，有利于获得所需的体外实验模型细胞，为进一步研究血管内皮细胞的生物学特性及其与各种疾病的关系提供帮助。此外血管内皮生长因子有助于培养的胚胎干细胞分化为内皮细胞。小牛血清和谷氨酰胺，在维持内皮细胞正常生长和形态结构的前提下尽可能减少完全培养液的组分，能获取足够数量高纯度可传代的内皮细胞，对内皮细胞生物学特性和心脑血管相关疾病的研究有重要意义。

三、发明内容

技术问题本发明主要是提供一种人脐静脉内皮细胞HUVEC的分离、培养与传代方法。

技术方案本发明主要是提供一种本发明为一种人脐静脉内皮细胞HUVEC的分离、培养与传代方法，包括了以下步骤：

1)HUVEC的分离：取当天新生儿15-20cm长的新鲜脐带，放入无菌含双抗的PBS溶液中4℃储存；用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌含双抗的PBS溶液冲洗至流出液体中无可见血液；夹住脐带下端，加入15ml的胶原酶I型(1mg/ml)37℃水浴消化10-15分钟；消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50ml无菌离心管中，用无菌含双抗的PBS溶液冲洗脐带2-3次；将收集液离心(2000转/分)5分钟；倒去上清，加入10ml M199培养基(含酚红、20％新生小牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、100μg/ml血管内皮细胞生长因子-肝素)，用弯管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，于CO₂培养箱在37℃培养。

2)HUVEC的培养：HUVEC细胞在37℃培养24小时后，倒掉培养基，并用无菌含双抗的PBS溶液清洗2-3次，洗掉红细胞和死细胞，加入10ml新鲜的M199培养基；以后每2天换一次培养基，一般培养5-7天，细胞可长满至80-90％单层，正常的内皮细胞长满后如同卵石状，这时可以传代。

3)HUVEC的传代：倒掉培养基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2-3ml消化液(0.25％胰酶+0.1％EDTA)消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，即加入2-3倍的有血清的DMEM培养基终止反应；用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个50ml无菌离心管中，2000转/分，离心5分钟；倒掉上清，加入20ml新鲜培养基，一般一瓶细胞可传代2-3瓶。选择传代2-3代的HUVEC(培养了20天左右)用于实验。

有益效果本发明旨在建立一种简单、高效分离培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的方法。本方法选用脐带作为血管内皮细胞的来源，不仅取材及操作方便，获得细胞数多，且脐静脉在很多方面具有与动脉生物学特性相似的优点。

四、具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例1

取当天新生儿20cm长的新鲜脐带，放入含双抗的无菌PBS溶液中，4℃储存；用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用PBS溶液冲洗至流出液体中无可见血液；夹住脐带下端，加入15ml的胶原酶I型(1mg/ml)37℃水浴消化15分钟；消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50ml无菌离心管中，用PBS溶液冲洗脐带3次；将收集液2000r/min离心5分钟；倒去上清，加入10ml M199培养基(含酚红、20％新生小牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、100μg/ml血管内皮细胞生长因子-肝素)，用弯管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，于CO₂培养箱在37℃培养。24小时后，倒掉培养基，并用PBS溶液清洗3次，加入10ml新鲜的M199培养基；以后每2天换一次培养基，培养6天，倒掉培养基，用无菌的PBS溶液清洗3次，加入2ml消化液(0.25％胰酶+0.1％EDTA)消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，即加入3倍的有血清的DMEM培养基终止反应；用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个50ml无菌离心管中2000r/min离心5分钟；倒掉上清，加入20ml新鲜培养基。传代3代的HUVEC用于实验。