[发明专利]3,5-二硝基苯甲酰胺在制备抗结核药物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及化合物的新用途，具体地说，涉及3,5-二硝基苯甲酰胺在制备抗结核药物中的应用。

背景技术

目前，抗结核药物在临床上的滥用现象，使结核菌耐药性的问题日益突出，而曾使肺结核的死亡率降低了80%的抗结核药物现在对大多数的肺炎球菌都无效。据统计，在我国结核病每年新发病例145万，每年新发肺结核患者的耐多药（对利福平和异烟肼两种或两种以上抗结核药物耐药）率为8.32%，广泛耐药（几乎对所有的抗结核药物都耐药）率为0.68%。因此，寻找新的抗结核药物是目前抗结核工作的重点。而在抗结核药物研发中，多数的药物作用靶点，都是从抑制结核菌的生存为出发点，而采用该模式筛选到的抗结核药物，很容易使结核菌在药物的选择压力下，产生对药物的耐受。所以，寻找不容易导致耐药产生的新靶点，并以此为靶点筛选出活性化合物，给结核病的治疗提供了新思路。

以结核分枝杆菌ESX-1分泌系统为靶点，开展抗结核药物的研究。ESX-1分泌系统（Ⅶ型分泌系统）主要由RD1(region of difference 1)区编码，包括9个基因(Rv3871～Rv3879c)，全长约9.5kb。该基因区在BCG疫苗株和一些非致病性结核分枝杆菌如田鼠分枝杆菌（Mycobacterium microti）中是缺失的，因此，该基因区在体外不影响结核菌的生长。但是在体内，结核分枝杆菌的ESX-1分泌系统介导多种毒力因子的分泌，在结核杆菌的致病性中起着关键作用，ESX-1分泌系统参与了结核分枝杆菌与宿主细胞的结合，引起细胞溶解，促进肉芽肿的形成，抑制吞噬体成熟；同时能够调节宿主细胞的相关免疫反应，对减少感染的巨噬细胞的细胞因子分泌反应起重要作用。如果将完整的RD1区整合入BCG疫苗株中，整合株在小鼠肺内的持留或增殖能力大大增强，并且也增强了其在宿主细胞内的存活能力。在ESX-1系统中，Rv3869、Rv3870和Rv3877分别有1、3和11个跨膜区，这三种蛋白同ESX-1分泌系统具有ATP酶活性的Rv3871共同形成一个膜结合的ESX-1分泌复合体，Rv3871与CFP-10的C末端信号肽结合，将CFP-10和ESAT-6转运到胞外。CFP-10和ESAT-6通常以二聚体的形式存在，CFP-10的C端具有信号序列，其C末端的七个氨基酸是CFP-10蛋白分泌所必须的，它还可以介导异源蛋白的分泌，如果将泛素的C末端连接这七个氨基酸，泛素能够被分泌至胞外。

以ESX-1分泌系统为靶点，寻找能够抑制该系统发挥功能，又不抑制分枝杆菌生长的抗结核药物，这样既可以降低结核菌的毒力和细胞内的生存力，又能够减少产生耐药性的可能性。相对结核分枝杆菌而言，海分枝杆菌生长速度相对较快、存在ESX-1分泌系统且生物安全性较高，目前已广泛用于结核病发病机制的研究。选择内源性表达ESX-1分泌系统的海分枝杆菌为模式生物，以CFP-10与荧光素酶（Luciferase简称LUC）融合作为报告基因，构建外源表达CFP-10和荧光素酶融合蛋白的重组海分枝杆菌，建立ESX-1分泌系统抑制剂的筛选模型。

3,5二硝基苯甲酰胺又名硝苯酰胺，一般用作抗球虫药，优点是抗药性产生得较慢，而对于其抗结核的作用从未有过报道。

发明内容

本发明的目的是提供3,5-二硝基苯甲酰胺在制备抗结核药物中的应用。

为了实现本发明目的，本发明通过构建外源表达来自于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中的CFP-10蛋白和报告蛋白的融合蛋白的重组海分枝杆菌，以该重组菌作为针对ESX-1分泌系统的抗结核病药物高通量筛选模型，向含有该重组菌的培养液中加入一定浓度的3,5-二硝基苯甲酰胺，培养一段时间后离心取上清测定报告蛋白的表达量或活性，以此来评价3,5-二硝基苯甲酰胺对ESX-1分泌系统的抑制活性。

前述的报告蛋白为荧光素酶、氯霉素乙酰基转移酶、β-半乳糖苷酶、分泌型碱性磷酸酶或荧光蛋白家族中的成员，优选报告蛋白为荧光素酶。

进一步地，本发明提供一种抗结核药物，其有效成分为3,5-二硝基苯甲酰胺。任选含有药用赋形剂。优选所述抗结核药物为液体剂型、注射剂型、片剂、丸剂、颗粒剂或胶囊剂等。

本发明选择结核分枝杆菌生长非必需但与其致病性密切相关的ESX-1分泌系统为药物靶点，构建抗结核病药物高通量筛选模型，利用该模型首次筛选出既能降低结核分枝杆菌的致病性又不抑制其体外生长，即不易诱发耐药的新型抗结核活性化合物--3,5-二硝基苯甲酰胺，为进一步研究该化合物在抗结核药物的临床应用奠定了基础。

附图说明