[发明专利]一组结核分枝杆菌菌体特异性抗原及其纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一组结核分枝杆菌菌体特异性抗原及其纯化方法。

背景技术

据2000年全国第四次结核病流行病学调查结果显示，结核病在我国仍是一个非常严重的公共卫生问题，卫生部近年来公布的全国法定报告传染病疫情结果显示，结核病发病数为第一位，可见结核病仍然是我国公共卫生的主要问题。

因此，对结核病诊断的研究具有重要的现实意义。目前研究结核病原菌（即：结核分枝杆菌）的重要目的之一是鉴定具有产生细胞免疫和体液免疫功能的分支杆菌抗原成分，用于发展新的结核疫苗和诊断方法。至今虽然对结核分枝杆菌抗原成份研究了50多年，但对其仍不是非常清楚。相比较而言，研究比较清楚的人型结核分枝杆菌抗原成分有ESAT-6、Ag85、12KD、16KD、19KD、38KD、65KD、71KD、88KD、MTB32、MPT63等多肽成分，这些抗原在结核分枝杆菌成份组成中具有一定的特异性。

目前诊断结核病的实验室技术有厚涂片抗酸染色、结核菌培养、ELISA技术、胶体金技术、DNA探针技术和PCR技术等。厚涂片抗酸染色、结核菌培养的阳性率只有30-40%。ELISA、胶体金技术已广泛应用于临床肺结核诊断，但是由于所用于检测的抗原成份不够理想，使抗体诊断阳性率只能达到50-80%左右，而且特异性比较差，不能满足临床的需要，因此寻找一种灵敏性强、特异性高的抗原成分成为当前结核病特异性抗体检测的首要任务。PCR技术是近年来发展起来的高新技术，但是受标本取材质量的影响，以及对非排菌病人、肺外结核病人无能为力，限制了PCR技术应用的范围。由于上述原因，研究、发展新的用于诊断的理想抗原及开发敏感性强、特异性高、实用性广泛、简单易行的检测方法，成为当前结核病特异性诊断的首要任务。

结核分枝杆菌菌体细胞壁20-40％的成份是由类脂质组成的，使结核分枝杆菌的破碎和溶解比较困难，导致菌体蛋白释放不完全，这也是结核杆菌抗原成份研究进展缓慢的原因之一。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，公开了一组灵敏性强、特异性高的结核分枝杆菌菌体特异性抗原及其纯化方法。

本发明的技术方案为提供一组结核分枝杆菌菌体特异性抗原，所述抗原为结核分枝杆菌菌体32-43KD分子量的多肽抗原组。

本发明的另一技术方案为提供一组结核分枝杆菌菌体特异性抗原的纯化方法，包括以下步骤：

（1）使用玻璃匀浆器20-40分钟，使结核分枝杆菌菌体破碎；

（2）将菌体匀浆液超声裂解20-40分钟；

（3）将菌体裂解液经表面活性剂处理5分钟，所述表面活性剂包括质量百分数为1%的十二烷基硫酸钠和质量百分数为0.1%的巯基乙醇；

（4）菌体表面活性剂处理液经Sephacryl S-200凝胶柱分级分离；

（5）分级分离液再经Sephadex 75凝胶柱分级分离;

（6）电泳鉴定分级分离收集结核分枝杆菌菌体32-43KD多肽抗原组。

优选的，上述的结核分枝杆菌菌体特异性抗原的纯化方法，所述步骤1）中的菌体为结核分枝杆菌毒株、低毒株或无毒株。

优选的，上述的结核分枝杆菌菌体特异性抗原的纯化方法，所述步骤1）中的菌体为H37Ra减毒株菌体。

优选的，上述的结核分枝杆菌菌体特异性抗原的纯化方法，所述步骤1）中使用玻璃匀浆器匀浆30分钟。

优选的，上述的结核分枝杆菌菌体特异性抗原的纯化方法，所述步骤2）为将菌体匀浆液超声裂解30分钟。

本发明的优点是：本发明提供一组敏感性和特异性高的结核分枝杆菌菌体特异性抗原。结核分枝杆菌菌体细胞壁20－40％的成份是由类脂质组成的，使结核分枝杆菌的破碎和溶解比较困难，导致菌体蛋白释放不完全，这也是结核杆菌抗原成份研究进展缓慢的原因之一。本发明设计了一套匀浆、超声、表面活性剂处理的程序，对结核分枝杆菌菌体进行破碎、溶解。总溶解率达90％以上，提高了抗原成份分析的可信性。

附图说明

图1：从左到右分别为13种分支杆菌标准菌株菌体多肽SDS-PAGE区带图谱，1、H37Rv株，2、H37Ra株，3、Bovis株，4、BCG株，5、鸟分枝杆菌，6、偶然分枝杆菌，7、耻垢分枝杆菌，8、草分枝杆菌，9、次要分枝杆菌，10、不产色分枝杆菌，11、堪萨斯分枝杆菌，12、革登分枝杆菌，13、土地分枝杆菌；

图2：结核病人血清中结核分枝杆菌多肽抗原相应抗体谱检测结果；