[发明专利]一种类凝血酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种蛇毒类凝血酶及其编码序列、含有该序列的重组质粒和菌株，以及由所述序列编码的类凝血酶在大肠杆菌中的表达及其应用。

技术背景

蛇毒类凝血酶主要存在于蝮亚科（Viperidae）和蝰科（Crotalidae）家族，是丝氨酸蛋白酶中的肽链内切酶，属于胰蛋白酶家族。主要功能是特异性的水解纤维蛋白原，释放纤维蛋白肽A（Fibrinopeptide,FPA）和B（FPB）。类凝血酶不激活凝血因子，降解纤维蛋白原产生可溶性、侧链不交联的高聚纤维蛋白肽片段，形成的（血）凝块不稳定，在体内易被网状内皮系统或正常纤溶系统清除。鉴于蛇毒类凝血酶在降解纤维蛋白原时的独特生物活性，已作为抗血栓药物用于心血管疾病和血液栓塞性疾病及术后血栓形成的预防和治疗有多年的历史。在临床上除用于脑梗塞、血栓闭塞性脉管炎、股动脉栓塞、肺栓塞等血管栓塞性疾病及预防术后血栓再发等治疗外，对肾病、红斑狼疮、病毒性肝炎及雷诺氏病等有一定疗效。

针对蛇毒类凝血酶的研究可追溯到上世纪三十年代，迄今商品化的蛇毒类凝血酶制剂有马来西亚红口蝮蛇（Calloselasma rhodostoma）类凝血酶Ancrod（商品名Arvin^TM）、美洲矛头蝮蛇（Bothrops atrox moojeni）类凝血酶Batroxobin（商品名Reptilase^TM）、尖吻蝮蛇（Deinagkistrodon acutus）类凝血酶Acutin（商品名Defibrase^TM）、长白山乌苏里蝮蛇（Gloydius ussuriensis）类凝血酶Gussurobin（商品名Defibrase^TM）以及短尾蝮蛇（Gloydius brevicaudus）类凝血酶“抗栓酶”。这些酶来源于天然蛇毒，多个因素限制了它们的规模化制备和临床应用。蛇毒含有多种毒性蛋白水解酶，影响血液循环和神经系统，即使是痕量残留都可引发副反应，严重时可致死。高纯度的蛇毒类凝血酶耗费高额分离纯化成本。此外，国家法律明确规定对稀有物种和生态资源的保护，强制禁止捕杀珍惜蛇种。综上所述，研发类凝血酶制剂的替代方案势在必行。

利用生物化学与分子生物学手段生产重组蛇毒类凝血酶避免毒性蛋白水解酶杂质残留造成的风险，同时易于产品规模化和产业化，是取代天然蛇毒类凝血酶制备的有效途径。研究发现，蛇毒类凝血酶活性中心序列存在高度保守性，利用机理研究较为透彻的大肠杆菌表达体系进行高效表达成为当前研究的重点。

另外，原核体系对外源基因表达无法建立正确的链内或链间二硫键，引起外源蛋白错误折叠，致使目的蛋白活力丧失或降低。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种蛇源的类凝血酶基因（将其命名为acutobin00-14），以及将其在大肠杆菌中克隆表达，解决上述现有技术的不足，构建能够高效表达的类凝血酶重组生产菌株，实现一种蛇毒类凝血酶的产业化生产，纯化所得目的蛋白可进一步拓宽其应用范围。

由于原核体系对外源基因表达无法建立正确的链内或链间二硫键，引起外源蛋白错误折叠，致使目的蛋白活力丧失或降低。为克服这一问题，本发明采用融合硫还原蛋白基因的pET-32a质粒载体，有效维系细胞内的二硫键以此来维系细胞氧化还原状态。同时，将质粒载体携带的His标签（多位六个组氨酸残基组成的序列）与目标蛋白融合，利用该标签特异性的与二价金属离子（如镍、锌等）发生螯合作用提高纯化效率。在His标签下游与多克隆位点间，该质粒存在一个肠激酶酶切位点，通过对融合蛋白酶切，可进行初步验证。

本发明的一种蛇毒类凝血酶基因，其核苷酸序列如SEQ NO.1所示，其编码的氨基酸序列如 SEQ NO.2所示。

所述类凝血酶基因经以下步骤获得：

（1）       从蛇毒腺中分离提取总RNA，将mRNA反转录为cDNA，再用PCR扩增；扩增结束后取PCR产物进行电泳检测,并回收凝胶中的目标基因；

（2）       将步骤（1）所得目标基因进行DNA序列测定，并在NCBI数据库中进行分析比对，最终确定类凝血酶基因。

将所述的类凝血酶基因克隆到pET-32a载体中，得到类凝血酶基因重组载体。

将所述重组载体导入大肠杆菌，得到含有类凝血酶基因重组载体的大肠杆菌细胞。

培养所述的含有类凝血酶基因重组载体的大肠杆菌细胞，通过发酵诱导其表达，产生类凝血酶。