[发明专利]一种饲用多功能微生物活菌制剂的制备方法

权利要求书

1.一种饲用多功能微生物活菌制剂的制备方法，其特征是：

A、种子纯培养：

（1）酿酒酵母、产朊假丝酵母的纯种培养

(a)菌种活化

无菌条件下取酿酒酵母或产朊假丝酵母的冻干菌种，划线接种于试管麦芽汁琼脂斜面，30℃培养18~36小时，至斜面上肉眼可见菌落时，即可准备移种；

(b)一级种子培养

无菌条件下用接种环挑取单菌落，接入装有种子培养液的三角瓶中， 30℃培养18~48小时，至菌体600nm吸光值为1-5左右时，可移种至二级种子；种子培养基组成为12Brix.麦芽汁；

(c)二级种子培养

无菌条件下、二级种子液以体积比10%的接种量接入50 L发酵罐，装量系数为v/v 60%，二级种子培养基为：葡萄糖30 g/L，酵母浸膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L，自来水定容，调pH6.0，30℃培养24小时，搅拌150r/min，通气量0.5 m³/h；当种子液600nm吸光值为5-10左右时，可作为二级种子液接入发酵培养基中；

(2)枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的纯种培养

(a)菌种活化

无菌条件下取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的冻干菌种，划线接种于试管营养肉汤琼脂斜面，37℃培养18~24小时，然后划线转接于营养肉汤琼脂茄子瓶斜面，37℃培养20~24小时，镜检当90%以上菌体形成芽孢时，即可准备移种；

(b)一级种子培养

用无菌水将茄子瓶斜面上的菌泥刮洗下来，装入内有玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡分散，获得均匀的菌悬液；将菌悬液在85℃水浴中加热5分钟，以体积比5%的接种量接入5L三角瓶中，三角瓶装量系数为v/v 40%；种子培养基组成为：葡糖糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏3 g/L，NaCl 5 g/L，自来水定容，调pH7.0-7.5，37℃培养18-24h，搅拌转速150r/min，通气量为0.5m³/h；当种子液600nm吸光值为2-5时，即可移种；

(c)二级种子培养

无菌条件下、将一级种子液按体积10%的接种量接入50 L发酵罐，装量系数为v/v 60%，二级种子培养基为：葡糖糖30 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 5 g/L，自来水定容，调pH7.0-7.5，37℃培养18-24h，搅拌转速150r/min，通气量为0.5m³/h；当种子液600nm吸光值为5-10时，即可移种；

(3)干酪乳酸菌的纯种培养

(a)菌种活化

无菌条件下取干酪乳酸菌的冻干菌种，接入装有活化培养基的试管中，进行静置厌氧培养；活化培养基组成为：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L,牛肉浸膏10 g/L，酵母浸膏5 g/L，K₂HPO₄2 g/L，柠檬酸二胺2 g/L，NaAc 5 g/L，吐温-80 1 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，MnSO₄·H₂O 0.05 g/L，CaCO₃ 20 g/L，pH6.5，37℃培养30-36h，然后以体积比10%的接种量转接于新鲜活化培养基中，37℃静置厌氧培养24-36h；

(b)一级种子培养

活化菌液以体积比10%接种量接入5L三角瓶中，三角瓶的装量系数为v/v 60%，种子培养基组成为：葡萄糖30 g/L，蛋白胨10 g/L,牛肉浸膏10 g/L，酵母浸膏5 g/L，K₂HPO₄2 g/L，柠檬酸二胺2 g/L，NaAc 5 g/L，吐温-801 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，MnSO₄·H₂O 0.05 g/L，CaCO₃10 g/L，pH6.5，37℃静置厌氧培养30-36 h；

(c)二级种子培养

无菌条件下、一级种子液以体积比10%接种量接入30 L发酵罐中，发酵罐的装量系数为v/v 80%，种子培养基组成为：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L,牛肉浸膏10g/L，酵母浸膏5g/L，K₂HPO₄ 2g/L，柠檬酸二胺2g/L，NaAc 5g/L，吐温-801 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，MnSO₄·H₂O 0.05g/L，CaCO₃ 10g/L，pH6.5，37℃静置厌氧培养30-36h；

B、酵母菌、芽孢菌和乳酸菌的混合培养

 (1) 混合发酵培养基的制备

按质量将红糖60-100g、玉米浆10-40g、硫酸铵5-20g、硫酸镁2-10g、磷酸二氢钾5-20g、磷酸氢二钾5-20g、柠檬酸二胺0.5-2g、氯化锌0.05-0.1g、氯化钙0.1-0.2g混合均匀，加入蒸馏水定容1升，充分搅拌溶解完全后密封加热至80-90℃灭菌0.5-2小时，冷却至室温备用；另配制浓度为1-5g/L的亚硒酸钠溶液100ml，经0.22μm无菌过滤器除菌，4℃下保存备用；

(2)混合发酵工艺

将按步骤A制备的酵母混合种子液、芽孢混合种子液、干酪乳酸菌种子液等二级种子液按体积比1~2: 1~2: 1~2混合，以V/W5%~20%的接种量将混合菌加入到灭菌的发酵液体培养基中，同时再加入一定量亚硒酸钠溶液使得发酵培养基中的亚硒酸钠终浓度为10~50 mg/L，在30-37℃，转速50-200r/min，通气量0.5-2m³/h下，培养24-36h，然后厌氧静置培养24-48h，直接制得液态饲用多功能微生物活菌制剂。