[发明专利]昆虫β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体涉及昆虫β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因序列及其dsRNA的应用。

背景技术

在我国长期施用有机氯、有机磷等化学杀虫剂防治害虫，导致一系列问题：农药残留导致农业环境污染；昆虫出现抗药性，防治成本提高；有毒农药危害人类身体健康等。目前已有将生物杀虫剂应用于害虫防治，但往往作用时间较长，效果缓慢。为更为有效地进行植物保护，迫切需要研发新型的害虫防治方法。

RNA干扰（RNAi）是一种通常由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默现象，于2006年获得诺贝尔奖。这一发现不仅是基因功能研究方法上的突破，同时也为人类的疾病治疗和作物害虫防治开辟了新的途径。2008年，Price和Gatehouse总结了众多研究结果后，提出了基于RNAi的害虫防治策略。基于RNA干扰技术的害虫防治具有如下优势：1）选择对害虫专一的基因进行干扰，对高等动物和和人类是安全的；2）防治害虫具有专一性，对非靶标生物无杀伤作用；3）对环境无毒无害。

发明内容

本发明的目的是提供一种昆虫β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因及其dsRNA在致死害虫中的应用。

本发明提供的一种β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。该序列是通过对飞蝗EST数据库的搜索，得到17条飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因基因片段，通过序列拼接和比对后，进一步克隆获得。该序列长2667bp，包含1845bp开放阅读框。

本发明提供的一种昆虫β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：2，是根据SEQ ID NO：1设计上游引物SEQ ID NO：3和下游引物SEQ ID NO：4，通过PCR扩增获得SEQ ID NO：2，其含有T7启动子。进一步利用试剂盒合成dsRNA。

所述dsRNA是用上游引物SEQ ID NO：3和下游引物SEQ ID NO：4合成PCR产物，经SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）试剂盒纯化后按照T7RiboMAXTM Express RNAi System（Promega）试剂盒说明体外转录合成。

SEQ ID NO：2合成的dsRNA在致死害虫中的应用：注射上述dsRNA到昆虫体腔，结果表明：SEQ ID NO：2合成的dsRNA可以特异性地沉默β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因LmNAG1的mRNA表达，并导致飞蝗蜕皮困难而死亡。

附图说明

图1：2龄飞蝗注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA后出现蜕皮困难而死亡的表型。A为注射dsGFP的对照，B为注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA。

图2：5龄飞蝗注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA后出现蜕皮困难而死亡的表型。A为注射dsGFP的对照，B为注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA。

图3：飞蝗注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA后飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因LmNAG1的不同时间点mRNA表达，β-actin做为内参基因。24，48，72为注射dsRNA后的小时数。**P<0.01。

具体实施方式

实施例1：飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因片段及其dsRNA的获得

1、飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因片段的获得

1）飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因在飞蝗表达序列标签EST数据库的搜索

基于飞蝗的表达序列标签（EST）数据库，采用生物信息学方法对飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因进行搜索，经过序列分析及比对后，共获得17条飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因片段。经拼接后，获得的飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因（LmNAG1）序列全长2667bp，开放阅读框1845bp。

2）飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因引物的设计

基于已获得LmNAG1的碱基序列，采用primer premier5.0软件设计引物。所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。

3）飞蝗总RNA获得

选取大小一致雌雄各半飞蝗5龄若虫，四头一组，冷冻于液氮中，待提取RNA，具体操作步骤参照TaKaRa Trizol试剂盒。

4）第一链cDNA的合成

参照M-MLV反转录TaKaRa试剂说明书，进行第一链cDNA的合成。