[发明专利]GDSL蛋白在制备脂肪酶中的新用途

说明书

技术领域

本发明涉及GDSL蛋白在制备脂肪酶中的新用途。 

背景技术

脂肪酶(1ipase，triacylglycerolacylhydrolases，EC3．1．1．3)即三酰基甘油酰基水解酶，是工业酶制剂中最重要的酶类之一，能够在油水界面催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，同时还能催化酯交换、转酯、酯合成、醇解、酸解、氨解等多种化学反应，通常具有催化效率高、催化条件简单的优点。 

目前工业上应用的脂肪酶大多为微生物产生的胞外酶，从反应温度来说多为中温酶（最适反应温度37-40℃），在高温下反应受到限制。嗜热酶是指最佳催化温度60-85℃的酶，具有化学催化剂无法比拟的优点，如催化效率高、作用温度广泛（在高温下的稳定性也较好）、作用pH广泛等，因而能克服中温酶(20-55℃)及低温酶(2-20℃)在应用过程中出现的生物学性质不稳定的现象，可以取代传统的中温酶催化及化学催化，为优化工艺流程开辟了一条新途径。 

利用热稳定性好的脂肪酶作为生物催化剂具有如下优点：(1)由于该脂肪酶的稳定性高，可在室温下分离提纯和包装运输、并能长久保持活性，从而制备脂肪酶的成本降低；(2)对反应器冷却系统的要求标准低，从而减少了能量消耗，且由于其耐高温特性，在生产中不需要复杂的冷却装置，既节省了开支又降低了冷却过程对环境造成的污染；(3)随反应温度的提高，酶分子运动速度加快，催化能力加强，加快了动力学反应，从而使用效率得到了提高；(4)由于采用高温反应条件，降低了中温微生物污染反应体系的危险，从而提高了产物纯度，同时高温反应条件还提高了有机化合物的生物可利用性和可溶性，从而实现了有效的生物修复。 

脂肪酶的热稳定性问题一直是脂肪酶研究及生产和应用的瓶颈问题，就目前脂肪酶的研究现状来看，仅通过蛋白质工程来改善脂肪酶特性，远不能解决各个领域对脂肪酶的要求。因此，寻找发现具有新特性、耐热、高活力、符合现代生物工程要求的脂肪酶是一项非常有意义的工作。 

发明内容

本发明的目的是提供GDSL蛋白在制备脂肪酶中的新用途。 

本发明提供了GDSL蛋白的应用，为如下（1）或（2）： 

（1）制备脂肪酶；（2）降解脂肪酶的底物； 

所述GDSL蛋白是如下（a）或（b）： 

（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 

（b）将序列表的序列2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白质。 

应用所述GDSL蛋白降解脂肪酶的底物时，所述降解的反应条件为30-80℃、pH6.5–8.0，所述降解的反应条件优选为65℃、pH7.5。 

所述脂肪酶的底物为对硝基苯基乙酸酯、丁酸对硝基苯酯、4-硝基苯基辛酸酯、4-硝基苯基葵酸酯、4-硝基苯基月桂酸酯和4-硝基苯基棕榈酸酯中的至少一种。 

本发明还保护将重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌；所述重组质粒为将所述GDSL蛋白的编码基因插入载体pET-28a(+)的多克隆位点得到的重组质粒。 

所述GDSL蛋白的编码基因具体可为如下1）至4）中任一所述的DNA分子： 

1）序列表的序列3自5’末端第1至792位核苷酸所示的DNA分子； 

2）序列表的序列3所示的DNA分子； 

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码具有脂肪酶活性的蛋白的DNA分子； 

4）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有脂肪酶活性的蛋白的DNA分子。 

所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。 

本发明还保护一种制备GDSL蛋白的方法，是培养以上所述的重组菌，得到所述GDSL蛋白。所述方法中，所述培养的具体步骤为：将重组菌接种至LB液体培养基(含100μg/mL卡那霉素)，振荡培养至OD₆₀₀达到0.8，然后加入IPTG（诱导剂）至浓度为1mmo/L，20℃、200rpm振荡培养12小时。所述方法中，在培养重组菌后还包括超声破碎和将超声破碎的上清进行亲和层析的步骤。所述超声破碎的具体参数为：功率300W、总工作时间90min，每工作5s间歇8s），12000rpm离心10min，收集上清液。所述亲和层析具体可为镍柱亲和层析。