[发明专利]一种花药愈伤组织继代培养获得橡胶树胚状体的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织和细胞工程领域，具体地说，涉及一种花药愈伤组织继代培养获得橡胶树胚状体的方法。

背景技术

橡胶树体胚植株具有生长快、产量高等优点，其产量较同源老态芽接无性系增加25.8%～66.3%，生长快10%～20%，是天然橡胶产业发展的新一代种植材料。世界上最早的橡胶树体胚植株是我国于1977年通过花药再生的。随后，马来西亚、印度也得到了花药植株。但是植株诱导频率均很低。在组织培养过程中发现，体胚诱导频率低、正常胚状体比例低是影响橡胶树花药培养发展的重要限制因子，因此如何培养出数量多、质量好的胚状体成为橡胶树组织培养工作者30多年来的主要研究方向。研究者主要从愈伤诱导及体胚分化培养基的大量元素、激素配比、蔗糖纯度、椰子水的质量、活性炭的添加及培养温度等进行研究。经过30多年的努力，体胚诱导频率得到了有效提升，但总体仍偏低。

培养基必须与好的培养方式搭配才能取得最好的效果。而至今依然沿用最初的培养方式，即花药---愈伤组织---体胚---植株再生。组织切片结果表明,花药愈伤组织在1～4周处于细胞启动期和细胞分裂期，此时愈伤组织开始形成并迅速增殖。4周后开始启动分化，愈伤组织边增殖边分化，5周看到大量的胚性细胞团。因此推断4周是花药愈伤组织分化的关键时期，与此前愈伤诱导担负着完全不同的使命，是启动体胚分化的时间节点。而一直沿用的培养方式仍将其放在诱导愈伤组织的培养基，可能是导致胚状体诱导频率偏低的一个原因。2011年梁国平等研究了继代次数对橡胶树花药愈伤组织体胚分化的影响，研究以40天的愈伤组织作为继代的起始材料，继代培养基同愈伤诱导培养基，共继代8次，结果表明继代1次的体胚分化率最高。最优条件下，体胚分化率为70.8%，而不继代时体胚分化率为39.8%。但是在研究中发现，直接以初代培养基作为继代培养基并不能提高体胚分化率，不继代的体胚分化率为35%，而直接以初代培养基作为继代培养基的体胚分化率为21.8%。而且2011年梁国平等的研究以40天的花药愈伤组织作为起始材料，此时已达最大愈伤生长量,组织切片可看到胚性母细胞或原胚,不适合继代培养。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效获得橡胶树体细胞胚状体的方法，以满足生产和实验的需要。

为了实现本发明的目的，本发明所述的一种花药愈伤组织继代培养获得橡胶树胚状体的方法，包括如下步骤：

（1）花药初代愈伤组织的诱导：以巴西橡胶树花蕾为外植体，将花蕾进行表面消毒，花蕾的消毒过程是将花蕾用75%酒精表面消毒30～60秒后，用0.1%氯化汞消毒10～15分钟，再用无菌水冲洗3～6次，每次3～5分钟；然后将消毒好的花蕾中的雄蕊剥出，接种到诱导愈伤组织的诱导培养基上进行暗培养，培养温度为24℃～30℃，暗培养28～35天，以诱导出橡胶树花药初代愈伤组织；

所述的愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并将MS培养基中磷酸二氢钾、无水氯化钙、一水硫酸锰、七水硫酸镁的含量调整为磷酸二氢钾350～500mg/L、无水氯化钙150～400mg/L，一水硫酸锰10～40mg/L，七水硫酸镁400～600mg/L；并添加2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）0.5～3mg/L、KT(激动素)0.5～3mg/L、NAA（α-萘乙酸）0.5～3mg/L、Phytage l(植物凝胶)2～4g/L、蔗糖50～90g/L和椰子水50～100ml/L。

（2）愈伤组织继代培养：选取培养期处于28～35天的橡胶树花药初代愈伤组织，转入愈伤组织继代培养基暗培养，培养温度为24℃～30℃，暗培养15～30天，培养出继代胚性愈伤组织；

所述的橡胶树花药初代愈伤组织转入愈伤组织继代培养基的继代培养次数为1次，待愈伤组织停止增殖时，立即转入橡胶树胚状体诱导培养基；

所述的愈伤组织继代培养基的有效成份为改良的MS培养基和附加成份，改良的MS培养基的成份为七水硫酸镁400～600mg/L，磷酸二氢钾350～500mg/L，无水氯化钙200～350mg/L，一水硫酸锰20～40mg/L，五水硫酸铜0.1～0.3mg/L；附加成份为6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）0.01～1.0mg/L、KT（激动素）0.01～1.0mg/L，3,4-D（3,4-二氯苯氧乙酸）0.05～1.0mg/L、ABA（脱落酸）0.001～0.1mg/L、Phytagel（植物凝胶）2～3g/L、蔗糖50～90g/L、椰子水40～90ml/L。