[发明专利]一种高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体及其应用。

背景技术

人神经巢蛋白简称Nestin，是一个中等纤维骨架蛋白，属于第Ⅵ类中间丝蛋白，因其在中枢神经系统发育过程中的瞬时性表达而被克隆，一直被作为神经干细胞特异性的标志。随着分子生物学和基因治疗技术的飞快发展，采用神经干细胞移植治疗脊髓损伤（SCI）已被公认为最新、最有前途的治疗方法之一。由于国内外科研机构将主要精力放在神经干细胞的体外培养、扩增、移植方面，因此，建立神经干细胞检测体系尤为重要。抗人Nestin单克隆抗体是对人神经干细胞进行鉴定最特异的方法，完全符合分子免疫学原理，但是，高效价、高特异性的抗人神经巢蛋白单克隆抗体目前尚未见到报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体及其应用。

本发明的整体技术构思是：利用细胞融合、亚克隆及多例多种组织和细胞的特异性筛选技术，获得高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体，由于此单抗效价高、特异性好，可直接应用于基础医学研究，或制成多种体外诊断试剂盒进行神经干细胞的鉴定和神经干细胞移植后的疗效评价。

本发明所述抗人神经巢蛋白单克隆抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或其重链可变区由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO.1的氨基酸序列至少有95%的一致性，轻链可变区由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO.2的氨基酸序列至少有95%的一致性且所述单克隆抗体具有特异性结合Nestin的活性。

作为优选，所述单克隆抗体包括单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。

本发明所述“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP．A-0120694和EP．A．0125023中描述。

本发明所述单克隆抗体可以是，例如，单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。

抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，EP．A．184187，GB 2188638A或．EP．A．239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。

用于本发明的单克隆抗体也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明人源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。

如上所述，本发明还提供了用于实施本发明抗体的试剂、试剂盒或芯片。试剂、试剂盒或芯片至少包括如下一种或多种：根据以上方法制成的抗体，编码该抗体的核苷酸，或包含该抗体的真核细胞、原核细胞和病毒以及任选的缓冲溶液。

本发明还具体公开所述抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法，它包括如下工艺步骤：

（1）动物免疫：将高纯度的人神经巢蛋白片段（LASTPIP PTPQAPSPAV）1ml充分乳化，免疫与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高纯度人神经巢蛋白，用酶联免疫吸附实验方法测定其抗血清；