[发明专利]一种利用生物反应器生产犬细小病毒灭活疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域。更具体地，本发明涉及一种利用生物反应器工业化生产病毒疫苗的方法。

背景技术

犬细小病毒病(Canineparvovirus disease，CPVD)是由犬细小病毒(Canineparvovirus，CPV)引起的犬的一种急性传染病。可在犬和猫之间传播，各种年龄的犬都能感染, 断奶后的幼龄犬最为易感，传播速度快，发病率和死亡率高达70％以上。自正式报道犬细小病毒病在我国流行以来，该病对我国养犬业造成了极大的危害。给动物接种疫苗是预防犬细小病毒感染的最有效的方法，目前国内生产犬细小病毒疫苗的方法多采用传统转瓶法或鸡胚生产工艺，但与当前大规模动物疫苗生产不相适应，主要体现在培养病毒滴度低、产品质量不均一稳定、批间差大，生产效率低等。因此，特别需要一种新的均一高效的生产犬细小病毒灭活疫苗的方法。

发明内容

本发明提供一种利用生物反应器工业化生产犬细小病毒灭活疫苗的方法，该方法是利用生物反应器载体系统培养制苗用细胞，感染病毒后可获得高效价的病毒抗原。该方法较现有的转瓶或鸡胚生产工艺具有病毒滴度高、质量均一稳定、生产效率高、过程可控性好的特点，是今后大规模工业化生产疫苗等生物制品的首要选择和发展方向。

本发明所采用的技术方案如下：

一种利用生物反应器工业化生产犬细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）应用生物反应器微载体和片状载体系统培养制苗用细胞；

2）接种犬细小病毒，进行生物反应器扩增病毒；

3）收获犬细小病毒的病毒培养液；

4）犬细小病毒经二乙烯亚胺（BEI）灭活，加入佐剂制备疫苗。

其中，优选的是，本发明步骤1）所用的制苗用细胞系为犬肾细胞系MDCK或猫肾细胞系F81。本发明步骤2）所接种的犬细小病毒毒株为CPV-2型病毒株。病毒是经过细胞适应性培养而来，具体方法为将犬细小病毒接种制苗用细胞后盲传，即取接种病毒后病毒培养上清按1：3的量接种新鲜培养细胞进行不断传代，待细胞出现典型病变或上清中可明显检测到病毒为止，一般传至3到5代即可，扩增并冻存病毒液作为反应器生产用毒种。

本发明进一步优选的技术方案是，所用的生物反应器带有Cell-Lift搅拌浆并使用Cytodex系列微载体培养系统；或者所用的生物反应器带有篮式搅拌浆并使用酯片载体系统；或者，所用的生物反应器为一次性激流式生物反应器并使用纸片载体培养系统。其中，Cytodex系列微载体的使用浓度为5-20g/L；酯片载体使用FibraCel disks圆盘状酯片载体，其使用浓度为200-2000g每批次；纸片载体使用国产一次性聚酯纤维纸片载体，使用量为160g或1200g每批次。

本发明进一步优选的技术方案是，步骤1）所述的生物反应器培养制苗用细胞工艺包含微载体单级或放大培养工艺，单级培养所用种子细胞为转瓶或细胞工厂培养贴壁细胞，放大培养所用种子细胞为生物反应器微载体系统培养所获细胞。单级培养优选为14L生物反应器单级培养模式，放大培养优选为14L到40L放大培养模式。具体放大方法为将微载体上生长细胞通过胰酶消化装置消化下来以后，连同新的微载体一起导入到新的更大体积的生物反应器中继续培养，依此方法放大到所需生产规模。本发明14L到40L放大培养模式采用一种胰酶消化装置消化细胞，避免了大规模消化细胞工艺繁琐及消化时间长的缺点，消化下来的细胞在微载体上重新贴附及生长状态良好。

本发明进一步优选的技术方案是，步骤1）所述的生物反应器培养制苗用细胞方式为补料分批培养方式或连续灌注的培养方式。其中，生物反应器片状载体系统培养方式优选为补料分批培养方式，生物反应器微载体系统培养方式则优选为灌注培养方式。

本发明进一步优选的技术方案是，步骤1）所述的生物反应器培养制苗工艺条件：温度为36℃-37℃，搅拌转速为40RPM -60RPM，溶氧（DO）为30%-60%，pH为7.0-7.2。

本发明进一步优选的技术方案是，步骤1）所述的生物反应器培养制苗用细胞所用的细胞生长液为分别添加5-10%的小牛血清的DMEM/F12、DMEM、MEM或199培养基，在一具体的实施例中，采用的培养基为添加8%的小牛血清的DMEM/F12培养基。