[发明专利]C型钠肽在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及C型钠肽在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用。

背景技术

在家畜繁殖上，广泛采用非激素刺激卵巢来源卵母细胞体外成熟后生产动物胚胎，因此体外卵母细胞成熟是一个重要的平台技术用于育种、克隆及转基因动物生产。

目前，优质种牛数量少、繁育速度慢、生产性能落后是制约我国养牛业健康、可持续发展的关键因素。牛的体细胞克隆胚胎（NTEs）以及体外受精胚胎（IVFEs）的细胞数，均明显低于体内胚胎，这反映了牛的体外培养体系还不理想。牛体外受精（in vitro Fertilization，IVF）胚胎质量是影响胚胎移植妊娠率和移植后后代犊牛成活率的重要因素。

近年来关于牛卵母细胞体外成熟培养（IVM）方面取得了较大进展。专利CN 102140435A、CN 101591637A、CN 100432219C公开了提高牛卵母细胞体外成熟的方法或新的培养液。但均是用于促进减数分裂恢复，促进卵母细胞体外生长成熟。这对于卵母细胞从卵泡转到培养液中后，在胞质未完全成熟的情况下提前恢复减数分裂，从而影响卵母细胞的发育能力。

为了提高卵母细胞的体外发育能力，许多学者模拟体内环境开发了卵母细胞体外两段成熟培养方法，即通过体外使用减数分裂抑制剂暂时可逆的阻止卵母细胞减数分裂恢复，同时促进卵母细胞生长发育，增强胞质成熟，然后移出减数分裂抑制环境，进行体外成熟。这种方法目的延长颗粒细胞与卵母细胞通过间隙连接进行物质和信息交流的时间，促进卵母细胞积累丰富的mRNA和蛋白质。但是，这些研究结果显示通过使用减数分裂抑制剂并没有提高牛卵母细胞体外发育能力，甚至产生了不利的影响（Gilchrist RB,et al.Comparison of oocyte factors and transforming growth factor-beta in the regulation of DNA synthesis in bovine granulosa cells.Mol Cell Endocrinol,2003,201:87–95.Lonergan P，et al.Bovine blastocyst production in vitro after inhibition of oocyte meiotic resumption for 24h.J Reprod Fertil,1997,109:355–365.）。

C型钠肽（CNP，C-type natriuretic peptide，C型钠尿肽，C-型利钠肽）为钠肽家族成员，一般认为以自分泌和旁分泌的方式调控动物心血管、神经系统、内分泌系统及繁殖性能。功能性C型钠肽由22个氨基酸组成，是生理活性物质，相对于化学合成的减数分裂抑制剂危害性应较小，用于卵母细胞体外成熟培养体系的建立可能具有一定的作用。

《Granulosa Cell Ligand NPPC and Its Receptor NPR2 Maintain Meiotic Arrest in Mouse Oocytes'》（Science，2010）文中提出一种模型来解释小鼠卵母细胞保持减数分裂的机制。通过NPPC（C型利钠肽前体）和NPR2（由卵丘细胞表达的一种鸟苷酸环化酶）突变体小鼠来验证NPPC和NPR2在保持卵母细胞减数分裂停滞的作用，突变体小鼠出现了促性腺激素非依赖性的减数分裂的恢复。

但上述只是一种机制研究，对于CNP能否抑制牛等家畜卵母细胞减数分裂，并用于体外受精、胚胎生产尚不确定，目前尚无此方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛卵母细胞体外成熟培养液。

本发明另一目的是提供一种促进牛卵母细胞体外成熟的方法。

本发明再一目的是提供C型钠肽在促进牛卵母细胞成熟中的应用及C型钠肽在制备用于促进牛卵母细胞体外成熟药物/减数分裂抑制剂药物中的应用。

所述牛卵母细胞体外成熟培养液以常规培养液为基质，所述基质中含有C型钠肽。

优选地，所述体外成熟培养液每1000mL组成为：

C型钠肽 200nM。

TCM199补足至1000mL。

牛卵母细胞采集后在添加CNP的组织培养液内前成熟处理6h，然后在成熟液内成熟24-28h，成熟后的卵母细胞进行体外受精，然后进行体外胚胎培养。

具体地，包括以下步骤：

1）采集牛卵母细胞；

2）将牛卵母细胞在所述牛卵母细胞体外成熟培养液中培养；