[发明专利]一种指甲隐球菌及其分离培养方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种指甲隐球菌及其分离培养方法与应用。

背景技术

随着实验室诊断技术的不断改进,对隐球菌的分类越来越系统化，一般分为:新生隐球菌、浅白隐球菌、指甲隐球菌、罗伦氏隐球菌、黄色隐球菌等。指甲隐球菌是一种带有荚膜的担子菌酵母，既往认为该菌仅引起人类甲真菌病。[Manzano-Gayosso P，Hernández-Hernández F,Méndez-Tovar LJ,et al.Onychomycosis incidence in type 2 diabetes mellitus patients.Mycopathologia.2008 Jul;166(1):41-5.]

现有文献也显示指甲隐球菌也能引起脑膜炎或其他真菌感染(参见文献：张旭辉，指甲隐球菌脑膜炎1例，《川北医学院学报》，1993年04期，81页；邝俊健等，对1例左胫腓骨骨折术后指甲隐球菌感染患者的药学监护，《中国药物应用与监测》2011年第1期，32-34页)。但这些研究并未对指甲隐球菌的鉴定方法和药物敏感性进行描述。

目前，尚无从脑膜炎患者肺部活检组织和脑脊液中分离培养纯化的指甲隐球菌。

发明内容

本发明的目的在于分离培养纯化一株新的可致人类脑膜炎的指甲隐球菌（Cryptococcus uniguttulatum）菌株，并提供其分离培养纯化方法，以及该菌株在筛选抗真菌药物中的应用。

上海长征医院皮肤科在一名37岁男性脑膜炎患者肺部活检组织和脑脊液中分离出一株隐球菌，经ITS测序和核糖体基因D1/D2区测序证实为指甲隐球菌。

本发明提供了一株指甲隐球菌（Cryptococcus uniguttulatus），已于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6017。

本发明分离纯化的该株指甲隐球菌，属担子菌门（Basidiomycota），银耳目（Tremellales）,线黑粉菌属（Filobasidiella）。

本发明还提供了所述的指甲隐球菌的分离培养纯化方法，该方法包括分离纯化步骤，具体是：将隐球菌脑膜炎患者肺部活检组织或脑脊液在30℃条件下接种于沙氏琼脂培养基平板和酵母浸出膏蛋白胨（YEPD）琼脂培养基，第2天生长，得到指甲隐球菌菌落。

进一步地，该方法包括指甲隐球菌菌种在30℃条件下于沙氏液体培养基和酵母浸出膏蛋白胨（YEPD）液体培养基进行振荡培养用于增菌。

所述的指甲隐球菌的分离培养纯化方法，该方法还包括培养和保存步骤，具体是：从-70℃冰箱中取出冻存管，立即放置于37℃水浴中并适当摇动30s，打开冻存管，取50μl菌液接入沙氏斜面培养基上；保存时将菌液涂布平板，48小时后放入4℃冰箱短期保存或放入含有25%甘油的YEPD液体培养基中-70℃冻存；

所述的沙氏斜面固体培养基的组分和重量百分比如下：葡萄糖4%、蛋白胨1%、琼脂1.5%，每1000ml，加200mg氯霉素，121℃10分钟灭菌后备用；

所述的YEPD液体培养基的组分和重量百分比如下：1%酵母浸出膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。

本发明对该菌株的形态特征、培养特征、碳源利用作了进一步研究。

本发明对该菌株进行鉴定：采用指甲隐球菌ITS1、5.8S rDNA和ITS2区扩增测序方法，具体为：合成以下真菌通用引物

上游引物ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’(如SEQ ID NO:1所示)；

和下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(如SEQ ID NO:2所示)；

以基因组扩增，PCR反应体系50μL：10×PCR buffer 5μL，2.5mmol/LdNTP混合物8μL，10umol/L引物各1ul，模板2ul，Taq酶0.5ul，无菌水32.5μL；

PCR扩增条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，70℃延伸2分钟，30个循环；72℃保存10分钟。

所得扩增产物由ABI 3730DNA自动测序仪双向测序两次。序列如SEQ ID NO:1所示。