[发明专利]一种高通量Small RNA测序获得番木瓜环斑病毒基因组序列的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物信息学和基因工程领域中的信息比对、拼接、组装和分子克隆技术，具体涉及一种高通量Small RNA测序获得番木瓜病毒基因组序列的方法，为新病毒的发掘和功能研究提供强有力的技术支持。

背景技术

高通量测序技术现已广泛应用于真核生物、原核生物、病毒等的基因组、转录组、基因表达调控研究，具体的分析技术包括：1De novo重头测序，2DNA重测序，3RNA转录组、表达谱测序，4MicroRNA发现及分析，5甲基化测序，6DNA-蛋白质互作研究，7目的区域捕获测序，8外显子测序。目前Illumina公司最近推出一种全新测序仪Hiseq2000，主要应用于基因组测序和注释，其性能较Genome Analyzer有更多的优点，表现在测序高通量、高精确度、易用性好、低成本等。Hiseq2000既有Illumina和Solexa在边合成边测序优势，又融合了最新的光学和信息系统设计及可逆中止化合物染料技术。Hiseq2000采用了4种含有末端阻断基团和不同荧光信号的碱基进行模板互补链的合成，确保了测序的高精确性和高顺序性。Hiseq2000具体有以下几个优点：1）Hiseq2000能够单次运行产生200Gb的数据，每天能产生25Gb；2）Hiseq2000具有最简化和直观的操作流程，启动运行只需要10分钟手工操作时间；3）操作Hiseq2000人员可以达到30倍的覆盖度对基因组测序，例如完成一个人类基因组测序只需不到1万美元费用，加快了自身推广应用。

目前Hiseq2000测序系统主要开展以下几方面测序及数据分析：

1、动植物基因组重测序：在已知物种基因组的情况下，对物种内的不同个体或某个个体的不同组织进行基因组重测序，可以在全基因组水平上发现不同个体或组织细胞之间的差异。通过这种方法，可以寻找出大量的单核苷酸多态性位点，插入缺失位点，结构变异位点，拷贝数变异等变异信息，从而获得生物群体的遗传特征。利用全基因组重测序有助于快速发现与动植物重要性状相关的遗传变异，缩短分子育种的实验周期。

2、真菌基因组测序：真菌属于较低等的真核生物，种类繁多，在自然界中分布广泛。据估计，全世界约有150万种真菌，其中包含许多具有重要的药用价值和食用价值的有益真菌，同时也存在着大量能引发动植物病害的致病菌。因此，合理利用有益真菌，控制预防有害真菌对人类的生产和生活具有重要的意义。而真菌基因组的阐明，将为真菌特性的分析提供有用的依据。

3、转录组测序 ：转录组即某个物种或特定细胞在某一功能状态下产生的所有RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的。转录组测序（RNA-Seq）是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。

4、外显子组测序：外显子组是一个物种基因组中全部外显子区域的总和，它是基因行使其功能最直接的体现。通过高通量测序技术进行外显子组测序，能够直接发现与蛋白质功能变异相关的遗传突变。相比于全基因组重测序，外显子组测序更加经济、高效。目前，外显子组测序技术已经应用到寻找与各种复杂疾病相关的致病基因和易感基因的研究中。

5、目标区域深度测序：指对感兴趣的特定基因组区域进行高通量测序，将研究者感兴趣的基因组区域定制成特异性的探针，通过这些特异性探针与基因组DNA进行杂交，富集基因组目标区域，最后将捕获到的基因组DNA进行高通量测序。

6、Small RNA深度测序：Small RNA是一类长度在20～30nt的RNA分子，主要包括miRNA、siRNA和piRNA。Small RNA能够调控基因的表达，在细胞的生长、发育、代谢等基础生物学过程中扮演着重要的角色，甚至在癌症等相关疾病形成过程中起着关键的作用。第二代高通量测序技术省去了烦琐的Small RNA克隆文库构建过程，可以一次性产生上百万条Small RNA序列，能够快速鉴定特定条件下表达的已知Small RNA并发现新的Small RNA，同时还可以研究不同条件下Small RNA的表达差异。