[发明专利]焦磷酸测序法检测B-raf基因多态性的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测B-raf基因多态性的试剂盒及方法。

背景技术

B-raf是一种癌基因，它编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学反应，如细胞生长、分化和凋亡等。研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、卵巢癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的B-raf基因突变，约66%恶性黑色素瘤和15％的结肠癌中B-raf基因存在体细胞错义突变。大约80-90%的B-raf基因突变发生在exon15的1799核苷酸上，T突变为A，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E)。

在结直肠癌中，B-raf突变率约为15%，其中约有90%以上的突变形式为T1799A（V600E），这与K-ras突变互相排斥。最新研究认为，K-ras突变可能导致30%-40%的结直肠癌患者对EGFR靶向治疗无效，而B-raf突变可能导致10%-15%的K-raf野生型患者发生耐药。

新上市的用于治疗晚期转移性或不能切除的黑色素瘤的药物Zelboraf，只能用于B-rafV600E突变患者

因此，对B-raf基因V600E多态性进行分型检测可预测患者对抗表皮生长因子受体的单克隆抗体的反应性以及Zelboraf疗效，为临床医生给结直肠癌及黑色素瘤制定药物治疗方案提供依据。开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测B-raf基因多态性的试剂盒将为抗表皮生长因子受体的单克隆抗体及Zelboraf的临床个体化治疗起到积极的推动作用。

焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。

发明内容

B-raf基因多态性是影响Zelboraf能否使用的最主要因素。本发明提供一种临床检测使用Zelboraf及抗表皮生长因子受体的单克隆抗体生物标志物的用药基因B-raf多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测Zelboraf及抗表皮生长因子受体的单克隆抗体个体化用药相关基因多态性。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种焦磷酸测序法检测B-raf基因多态性的试剂盒，包括如下引物：

（1）扩增引物：

B-raf上游引物：5′-CTTTCTAGTAACTCAGCAGCAT-3′（SEQ ID NO.2）；

B-raf下游引物：5′-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCT-3′（SEQ ID NO.3）；

其中，下游引物的5′进行生物素标记；

（2）测序引物：

B-raf测序引物：5′-CCACTCCATCGAGATT-3′（SEQ ID NO.4）；

试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。

一种应用上述试剂盒检测B-raf基因多态性的方法，包括如下步骤：

（1）DNA提取；

（2）聚合酶链反应：

配制50μl PCR扩增体系，包含：10×PCR buffer 5μl，dNTP 3.0μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，rTaq0.5μl，水39.5μl，模板1.0μl；按照下面的循环参数设置扩增仪：95°C 5min预变性；然后依次在95°C 30S，50°C 30S，72°C 30S，进行38个循环；再在72°C保持5min，最终保持在4°C，得扩增产物，扩增产物片段为163bp；

（3）焦磷酸测序单链样本纯化；

（4）焦磷酸测序及结果分析。

本发明的试剂盒对B-raf rs113488022目标序列进行分析和检测，该目标序列包括：野生型GTGATTTTGGTCTAGCTACAGAGAAATCTCGATGGAGTGGGT（SEQ  ID NO.5）和突变型GTGATTTTGGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGGAGTGGGT  （SEQ  ID NO.6）；扩增出的片段长为163bp。