[发明专利]甘蔗中性/碱性转化酶基因及其编码的蛋白质序列

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种甘蔗中性/碱性转化酶基因及其编码的蛋白质序列。

背景技术

高等植物组织中存在着多种转化酶的同工酶形式。根据最适pH可以分为两大类：酸性转化酶和中性/碱性转化酶。中性/碱性转化酶（Alkaline/Neutral Invertase）是一种胞质酶，最适pH值在7.0-8.0左右。该酶只以蔗糖为底物，能不可逆的把蔗糖分解为葡萄糖和果糖，用于能量代谢。在酸性转化酶和蔗糖合酶活性较低的植物组织中，中性/碱性转化酶能分解蔗糖，为三羧酸循环提供底物，因此它也被视为“维持酶”。

目前，已经在小麦、玉米、水稻、木薯、小果等植物中克隆得到该类酶的基因。由于其特殊的pH活性条件，酶活性极不稳定，在提取过程中容易丧失活力，导致纯化该类酶难度很大。己经纯化出来的中性或碱性转化酶主要以两种形式存在：八聚体和四聚体。中性或碱性转化酶N-端无信号肽、无糖基化，C-端富含半胱氨酸，且与酸性转化酶的同源性很低。研究发现重金属离子对中性/碱性转化酶没有抑制作用，而对酸性转化酶有抑制作用。因此，认为中性/碱性转化酶与酸性转化酶之间催化位点有明显差异。

研究发现，在胡萝卜不同发育期的各种组织都能检测到中性/碱性转化酶基因的表达，快速生长组织的表达量最高,表明中性/碱性转化酶可能与植物生长相关。乔永旭等认为甜瓜果实在成熟期之前，果实中转化酶活性逐渐降低。但是，只有当中性转化酶活性降低到一定程度之后，蔗糖才开始积累。刘永忠等认为柠檬细胞中的中性转化酶活性，随着果实成熟而下降，在成熟时保持极低水平，说明在果实成熟前，柠檬细胞中糖分的利用与中性转化酶活性有极大的关系。Qiet等（2007）运用图位克隆法在拟南芥突变体中克隆到1个中性/碱性转化酶基因，其在植物生长发育过程中发挥着多种作用，参与渗透胁迫诱导的抑制侧根的发育，抑制作用是通过控制细胞内己糖浓度实现的。Jia等研究发现，水稻短根突变体Oscyt-inv1的蔗糖含量增加时，己糖含量降低；外施葡萄糖能够恢复短根突变体Oscyt-inv1根的生长，表明OsCyt-inv1对水稻根系细胞发育和生殖发育有着重要的作用。

目前，对酸性转化酶的研究较多，而中性/碱性转化酶研究较少，仅在少数几种植物中克隆到中性/碱性转化酶基因全长序列，但到目前为止，还没有人在甘蔗上克隆到该基因。

发明内容

本发明的目的：为研究甘蔗中性/碱性转化酶基因的功能，应用甘蔗中性/碱性转化酶基因进行作物遗传改良，提供一种甘蔗中性/碱性转化酶基因及其编码蛋白序列。

本发明所采取的技术方案如下：

甘蔗中性/碱性转化酶基因及其编码蛋白序列，是在对所有植物中性/碱性转化酶基因全长序列进行进化分析的基础上，比对同一家族的中性/碱性转化酶基因cDNA序列，并设计扩增中性/碱性转化酶基因核心片段的引物，从甘蔗幼嫩叶片提取总RNA，并经反转录，用RT-PCR法扩增中性/碱性转化酶基因核心片段；在核心片段序列5′端设计三个特异引物，在核心片段序列3′端设计两个特异引物，通过RACE PCR技术分别扩增到中性/碱性转化酶基因核心区的5′端和3′端序列，三个序列经过拼接，获得甘蔗中性/碱性转化酶基因全长cDNA序列，总长2289bp，经VectorNTI软件分析，该基因的ORF为1812bp，编码603个氨基酸，起始密码子(ATG)位于287bp处，终止密码子(TAG)在2098bp之后还有一段191bp的带有真核生物典型的polyA尾巴的非编码序列。

本发明所获得的甘蔗中性/碱性转化酶基因核心区序列，是用以下核苷酸序列为引物扩增获得：

NIZJF2：（5′-gatcaggtgtttattcgggact-3′）；

NIZJR2：（5′-gtcgtagtactccggccatttgtc-3′）。

本发明所获得的甘蔗中性/碱性转化酶基因5′端序列，是用以下核苷酸序列为引物，与5′-Full RACEKit(TAKARA)提供的引物结合，鸟巢式扩增获得：

NISYF1：(5′-cctcatcaccatcaagcggaat-3′)；

NISYF2：(5′-ggcagtccattgtcttctccc-3′)；

NISYF3：(5′-gaagtcccgaataaacacctgatc-3′)。

本发明所获得的甘蔗中性/碱性转化酶基因3′端的序列，是用以下核苷酸序列为引物，与3′-Full RACEKit(TAKARA)提供的引物结合，鸟巢式扩增获得：