[发明专利]检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因芯片和检测方法，特别涉及一种检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片及其检测方法。 

背景技术

    猪呼吸道疾病综合征（PRDC）是一个有多重表现的疾病问题，已成为猪病中最为突出的疾病之一。PRDC是多种病毒和细菌同时或先后感染后产生协同效应和加性效应的结果，往往首先由病毒引起,并通常继发条件性病原菌感染。由于猪呼吸道疾病综合征是一种多因子疾病，不同猪场甚至同一猪场分离的病原都不同，针对这一疾病的诊断，传统的方法有血清学检测、单个病毒的PCR检测方法等，这些技术有的耗时长，有的费用高，且均不能进行多种病原体的同时检测，因此难以达到快速、准确、高通量的目的，导致了其诊断和防治的难度。 

1997年7月，Affymetrics ,Inc.(Santa Clara,CA)公司的Thomas,R.等人发明的第6,228,575号美国专利公开了以生物芯片技术对微生物进行定种和表型分析的方法。从二十世纪九十年代开始，基因芯片技术作为一种全新的核酸分析检测技术建立起来，并随着人类基因组计划的开展而逐步发展。随着基因芯片这一生物技术的发展，利用芯片的高通量、高敏感性、重复性和专一性的特点，可在同一张芯片上同时检测多个病毒基因，使得它与其它诊断技术相比，诊断速度和精确性显著提高。近年来，国内外关于利用基因芯片检测病原微生物的报道已有不少，例如，2001年Li等人在《临床微生物学杂志》中利用芯片技术分析了人流感病毒A和病毒B以及它们的亚型，并认为与基于PCR的诊断方法相比较，基因芯片技术是更有效的诊断方法。2006年Baxi等人在《兽医杂志》中将芯片技术用于口蹄疫的诊断和鉴定，认为该技术是唯一能同时鉴定和诊断多病原的方法。国内的学者们也先后将基因芯片技术成功用于人和动物的各种病毒和细菌方面等的检测，2007年陈红军等人在《畜牧兽医学报》中发表了猪流感病毒分型基因芯片的建立和初步应用的研究，肖国生等人在《中国兽医杂志》中发表了基因芯片用于病原微生物的检测和分型的研究，而杨林等人也分别在《中国兽医杂志》、《中国动物检疫》中公开了猪瘟病毒检测用寡核苷酸芯片探针的筛选以及猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒基因芯片检测技术的建立与优化的研究。因此，针对PRDC的诊断非常复杂和繁琐这一难题，利用芯片技术进行PRDC的诊断是一种较为有效的方法。目前尚未见有应用基因芯片进行猪呼吸道疾病综合症病毒检测的报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片及其检测方法。针对猪呼吸道疾病综合征是一种多因子疾病，传统的方法如血清学检测、单个病毒的PCR检测方法等都很难准确、及时的诊断的缺陷，本发明采用基因芯片技术，建立可同时检测引起猪呼吸道疾病综合征的几种不同病毒感染的基因芯片及其检测方法，提高该病的诊断效率，从而解决其临床上诊断困难的问题。 

本发明所采用的技术方案是：一种检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针和质量控制寡核苷酸探针，上述的该寡聚核苷酸探针包含从以下序列中选取的一种或多种序列： 

（1）                              猪繁殖与呼吸综合征病毒的NPS2基因，圆环病毒II型基因组序列990～1500bp之间的基因，伪狂犬病的gE基因和pK基因，猪流感病毒H1N1的HA、NA和M基因，猪流感病毒H3N2的HA、NA基因中选取的DNA序列；

（2）                              所述（1）中选取的DNA序列的互补DNA序列；

（3）                               所述（1）或（2）中选取的DNA序列的互补RNA序列。

所述的从猪繁殖与呼吸综合征病毒的NPS2基因，圆环病毒II型基因组序列990～1500bp之间的基因，伪狂犬病的gE基因和pK基因，猪流感病毒H1N1的HA、NA和M基因，猪流感病毒H3N2的HA、NA基因中选取的DNA片段具有SEQ ID NO：1 - SEQ ID NO：14所示的DNA序列中的一种或者多种DNA序列。 

所述的质量控制寡核苷酸探针包含杂交阳性对照探针、杂交阴性对照探针、芯片固定阳性对照探针。 

所述的杂交阳性对照探针包含Y5基因，具有SEQ ID NO：15所示的DNA序列。 

所述的杂交阴性对照探针包含tetK基因，具有SEQ ID NO：16所示的DNA序列。 

所述的芯片固定阳性对照探针具有SEQ ID NO：17所示的DNA序列。