[发明专利]一种检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用液相芯片的方法检测传染性喉气管炎病毒的方法。 

背景技术

传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis，ILT)是由疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科传染性喉气管炎病毒（ILTV）引起的一种急性、接触性上呼吸道传染病，以呼吸困难、咳出血样粘液、喉部和气管黏膜水肿出血继而糜烂为主要特征。由于引起产蛋下降和鸡群死亡而造成严重的经济损失，并且该病可感染各种日龄和品种的鸡。本病通常突然暴发，并很快在鸡群中传播，感染率约为90%~100%，致死率5%~70%，一般在10~20%之间。May等1925年在美国首次报道该病，现已遍及世界许多养鸡地区。我国自50年代以来大部分地区有不断发生的报道，多呈地方流行性，并且发病的日龄有提前的趋势。最早发病可见20-40日龄，给养鸡业造成严重损失，是集约化养鸡场的重要疫病之一。 

目前传染性喉气管炎的实验室诊断主要是病毒分离、血清学诊断、酶联免疫吸附试验、核酸探针、聚合酶链式反应等。病毒分离、血清学诊断和酶联免疫吸附试验这些方法虽然经典，但费时费力且敏感性差，不能检测亚临床感染，而传染性喉气管炎亚临床感染占有重要地位。PCR技术虽具有快速、特异、敏感和易于操作的特点，在畜禽传染病的检测、鉴别诊断方面得到了广泛应用但是不能进行高通量检测，不能满足高通量检疫的要求，更不利于大量通关样品的检疫和疫情暴发时大批量样品的紧急筛查，因而需要建立一套简便、快速、准确的传染性喉气管炎筛查和检验技术，以满足日常检测的要求。 

液相芯片（xMAP）技术是20世纪90年代中期发展起来的高通量检测技术。它是既可进行免疫学检测也可进行核酸检测的一种集流式技术、激光、荧光微球和数字信号处理为一体的新型生物分子高通量多重检测技术。液相芯片技术最突出的优点在于仅需少量样本即可同时定性、定量检测同一样本中的多种不同目的分子，即多重检测。具体说来，与常规免疫学或核酸检测方法相比，它具有高通量、样品需求量小、操作简单、灵敏度高、检测范围广、特异性强、重复性好的显著优点。 

液相芯片技术平台是既能保证信息质量，又能提供相对高通量的新一代分子诊断技术平台，这个技术平台整合了生物检测，微球荧光编码，微液体传送系统，激光实时记录，先进电脑软件和数据处理模式等多种先进技术。液相芯片的核心技术是把微小的微球分别染成上百种不同的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码）。应用时，把针对不同检测物的微球混合后再加入微量待检测标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合。结合的结果可以在瞬间经激光判定后由电脑以数据信息的形式记录下来。因为分子杂交是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称。 

液相芯片技术平台具有高效性：因为上百种颜色的微球可以在同一个反应体系内，所以一小份标本（血，或其它体液，组织）可以被用来同时检测上百个生理或病理指标。液相芯片技术平台具有高敏感性：每个乳胶微球上都可以满满地（以共价键牢固结合的方式）包被上抗原、抗体、或核酸。因为探针密度高，产生的信号强，加上使用荧光检测，所以敏感性大大高于任何现有分析、诊断方法，也高于其它芯片法。液相芯片技术平台是一种快速检测方法：因为杂交在悬浮的液相中进行，所以反应需要时间短，杂交后常不用清洗就可以直接读数，且检测效率大大高于固相杂交，所用时间从几 小时缩短到十几分钟。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片方法；本发明的目的还在于提供一种检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片试剂盒。 

查阅相关文献疱疹病毒的TK基因是高度保守的，ILTV不同毒株之间更加保守，英国株(Throne)和美国株(632株)TK基因仅相差3个连续的核苷酸。从GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中收集传染性喉气管炎TK基因序列，利用Bioedit分子生物学分析软件对大量收集的序列进行分析比较，根据实验目的筛选传染性喉气管炎的特异性保守序列。 

本发明在对序列分析的基础上，根据筛选的每个亚型的保守序列，参照GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中发表的传染性喉气管炎TK基因序列组序列（登录号：EF552574），应用DNAStar、Primer5.0、和Bioedit软件分别对其进行初步分析筛选，设计了传染性喉气管炎的特异性引物和探针，分别对下游引物进行生物素标记，对探针进行氨基修饰。