[发明专利]Caveolin-1基因突变的快速检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，分子诊断，实时定量PCR技术。

背景技术：

Caveolin-1基因位于人7q31.1上，含有3个外显子。在哺乳动物细胞内的Caveolin-1可根据N端的不同分为α型和β型(Caveolin-1α和Caveolin-1β)，它们的主要区别在DNA转录成mRNA时来自不同的起点。Caveolin-1α为24kDa，有178个氨基酸残基组成；Caveolin-1β为21kDa，由147个氨基酸残基组成。

Caveolin-1通过调控细胞周期抑制肿瘤发生。Caveolin-1正常表达后通过其N末端与周期蛋白D1（CyclinDl）基因的启动子结合，抑制CyclinDl的活性。Caveolin-1可以隔离脂肪中的磷酸化酪氨酸蛋白激酶Fyn（同步原癌基因）和SH2携带蛋白（Src homology 2 domain containing，Shc），阻止他们与α整合素相互作用，从而抑制层粘连蛋白诱导的细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）活化，通过核转录因子原癌基因蛋白（Jun）、即刻早期基因蛋白（Fos）和周期素D（Cyclin D）实现对细胞周期的负调控。Caveolin-1与鸟类肉瘤Schmidt-Ruppin A-2病毒癌基因同源物（c-Src）发生交互作用，抑制Src酪氨酸激酶的磷酸化，阻止其信号的向下传导。Caveolin-1抑制原癌基因唾液酸酶（Neu）表达产物的自身磷酸化，阻断Neu的信号传导。此外，Caveolin-1还能引起表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）、成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor，FGF）、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）和转化生长因子等的表达下调。通过多种途径，Caveolin-1抑制肿瘤的发生发展。

Caveolin-1基因的突变引起其表达产物表达的降低或活性的减弱，抑制其生理功能，与肿瘤的发生发展相关。在乳腺癌和胰腺癌中，Caveolin-1基因的突变率分别为35％和7％-10％。尤其是第132号密码子的P＞L的突变，是肿瘤细胞及组织中的热点突变。Lee等[6]在乳腺癌研究中发现Caveolin-1基因P132L的突变率达到16％。

众所周知，高分辨熔解曲线(high-re solution melt，HRM)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、配型等的分析。因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。而，高分辨率熔解曲线(HRM)是传统的熔解曲线分析的延伸:它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR与专门的分析算法；使我们可以不必测序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异（SNPs,mutations)。SYBR  Green I对PCR扩增有毒性，因此必需使用低浓度的染料，又因为它是非饱和态结合，染料在熔解过程中可重新结合，使其无法适用于HRM。