[发明专利]氯霉素免疫亲和凝胶检测柱

说明书

技术领域

本发明属于免疫学、酶学与分析化学领域，尤其涉及氯霉素免疫亲和凝胶检测柱的制备。

背景技术

氯霉素是一种广谱抗生素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较好的抑制作用。它通过与核糖体的50s亚基上的A单位结合，阻碍肤酞基转移酶的转肤反应，阻止肤链延伸，从而达到抑制细菌蛋白质合成的目的。因其效高价廉，曾在畜牧业中广泛应用于动物各种传染性疾病的治疗。但其有较强的毒副作用，国内外研究机构发现，食品中的氯霉素残留超标，容易引起人体血小板减少性紫殿、粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血等多种危害，特别是对早产儿和新生儿产生较为严重的毒性。近年来欧盟、美国等发达国家已相继禁止氯霉素用于动物源性食品，并明确规定氯霉素残留限量为不得检出。我国农业部已禁止使用该药，无论内销还是出口的畜产品，氯霉素残留都是必检项目。然而由于CAP抑菌效果好且价格低廉，目前我国仍有部分养殖主将CAP用于治疗禽类、家畜疾病。为保障人民健康及扩大与世界各国食品贸易往来，必须建立灵敏度高、特异性强、简单快速测定方法对氯霉素残留进行监控。

目前报到的氯霉素检测方法主要有：微生物法、酶免疫法、放射免疫法、高效液相色谱法和气相色谱法。微生物法的检测周期较长。气相色谱法虽灵敏度较高，但也存在一些不足，如样品前处理过程复杂、分析速度慢、仪器化程度高且价格昂贵，不适合在基层推广使用。高效液相色谱法虽操作简单，但检出限较高，无法满足当前对氯霉素低残留限量的要求。基于抗原抗体特异性反应建立起来的免疫学测定方法，一直是兽药残留快速检测和样品筛选方法的研究热点，其具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度较高、特异性强等诸多优点，具有广阔的应用前景。尤其是可视化快速免疫检测技术，如试纸条，不需任何仪器设备，儿分钟就可用肉眼观察实验结果，非常适合于大量样品的现场筛查和基层推广。然而试纸条检测也易受样品基质的影响，在不同食品样品检测中受到一定限制。本发明阐述的凝胶柱免疫检测产品为某些颜色较深及基质影响较大的样品中的氯霉素残留检测分析提供一种行之有效的可视化定性半定量快速简单检测方法，为食品安全的有力监管提供可靠的技术保障。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以定性半定量的检测食品中的氯霉素的简单、省时、灵敏的可视化的免疫亲和凝胶检测柱产品，凝胶检测柱是在一个标准的1mL固相萃取柱内设有两层：上层为氯霉素抗体胶与封闭胶混合加入形成的检测层，待测样品中含有的氯霉素可消除或减弱该层的颜色，从而根据胶体颜色深浅达到检测样品中的氯霉素的目的；下层为HRP抗体胶与封闭胶混合加入形成的质控层，只要检测过程加入酶标记物，该层都会显色。如果该层显色，则检测正常，如果该层无色，则检测失效，从而达到质控的目的。本发明采取的技术方案是：

封闭胶的制备

(1)溶胀：称取1.00g溴化氰活化琼脂糖凝胶，加入到80mL的配制好的HCl溶液中，搅拌溶胀10min(溶胀后胶的终体积约为3.5mL)。

(2)淋洗：将溶胀好的琼脂糖凝胶转移到在具砂板层析柱中，再加入200mL HCl淋洗，然后用偶联缓冲液冲洗柱子，调节柱子pH至中性。

(3)封闭：加入9mL甘氨酸封闭液，密封柱子，室温下震荡反应2h。

(4)清洗：首先加入10mL的偶联缓冲液淋洗一次，然后用10mL的醋酸钠缓冲溶液和10mL的偶联缓冲液分别冲洗3遍。

(5)贮存：待清洗液抽空，制备好的封闭胶用PBS悬起，约10mL PBS(含有0.3ml/L的抑菌素)，放置于4℃保存待用。

抗体胶的制备

(1)溶胀：准确称取0.50g溴化氰活化琼脂糖凝胶，加入到40mL的配制好的HCL溶液中，搅拌溶胀10min(溶胀后胶的终体积约为1.8mL)。

(2)淋洗：将溶胀好的琼脂糖凝胶转移到在具砂板层析柱中，再加入200mL HCL淋洗，然后用偶联缓冲液冲洗柱子，调节柱子pH至中性，将淋洗液全部淋完。

(3)偶联抗体：取0.50mg/mL抗体，用1mL的偶联缓冲液稀释，然后加入到在具砂板层析柱中，密封柱子，室温下震荡反应2h。

(4)封闭：加入10mL的偶联缓冲液淋洗柱子，然后加入10mL的封闭液，再次密封柱子，室温震荡反应2h。

(5)清洗：首先加入10mL的偶联缓冲液淋洗一次，然后用10mL的醋酸钠缓冲溶液和10mL的偶联缓冲液分别冲洗3遍；

(6)贮存：待清洗液抽空，制备好的抗体胶用PBS悬起，约5mL PBS(含有0.3ml/L的抑菌素)，放置于4℃保存待用。

检测柱的制备