[发明专利]一种透膜肽介导的反义抗菌剂及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种透膜肽介导的反义抗菌剂及其制备方法和应用。 

背景技术

金黄色葡萄球菌是医院内感染和社区获得感染最常见、最重要的致病菌，随着抗生素的广泛应用，金葡菌的耐药情况愈来愈严重。目前，90%以上的金葡菌对青霉素耐药，自1961年英国首次报道耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant staphylococcus aureus，MRSA）至今，由MRSA引起的感染已经遍及全球，且其检出率不断增高。MRSA对所有β-内酰胺类抗生素和其他多种抗菌药物耐药，因此由MRSA引起的感染，治疗十分困难，死亡率很高。目前治疗MRSA最有效的药物是万古霉素，然而随着耐万古霉素MRSA的出现，人们即将面临无药可用的境地，因此寻找新的特异性抗MRSA感染的新靶点及新策略成为细菌感染治疗领域的研究热点和难点。 

传统的抗菌药物的研发主要是对已知抗生素进行结构修饰，然而按照这种方法发现新先导物变得越来越困难，同时细菌产生耐药性的速度远远超过新抗菌药物的研发速度，所以必须寻找新的突破口。由于具有全新作用模式的抗菌药物可以大大减慢细菌产生耐药性的速度，因此目前抗菌药物的研究主要集中在寻找新的作用靶标和新的作用模式的药物。2005年美国AVI公司提出的反义抗菌剂是一种具有全新作用模式的抗菌药物——通过RNase H介导的靶RNA的降解及抑制DNA的复制和转录及转录后的加工和翻译等方式而抑制致病菌基因的转录、翻译进而抑制细菌的生长、繁殖，从而达到减毒、抑制或杀灭细菌的目的，该类药物是最具研发潜能的新型抗菌药物。 

与传统药物相比，以细菌治病基因为靶点的反义抗菌剂因具有高特异性、高效性、低毒、安全等特点，是极具开发潜能的新型抗菌药物。在众多种类的反义分子中锁核酸（LNA）作为一种新颖的核苷酸衍生物引起了人们的广泛关注，有希望成为分子水平治疗各种疾病的突破口。LNA是一种特殊的双环状寡核苷酸衍生物，结构中核酸的2′-O,4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，形成了刚性的缩合结构，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，所以它对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力，与其他寡核苷酸类似物相比，LNA有很多优点：1）和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性；2）具有抗3′脱氧核苷酸酶降解的稳定性；3）LNA-DNA杂交物能激活RNase H；4）体内无毒性作用；5）有高效的自动寡聚化作用，合成方法相对简单，部分或完全修饰的LNA寡核酸链可用氨基磷 酸法在DNA自动合成仪上合成，由此可见，LNA是一种理想的反义药物。 

然而，LNA充分发挥其反义作用的前提是必须在细菌细胞内的靶mRNA结合部位达到有效浓度，而LNA是荷负电荷的大分子化合物，不易透过细菌的细胞壁和细胞膜、胞内浓度低，并能非特异性的被机体细胞所摄取，因此高效的、特异性靶向细菌的递药载体是限制反义抗菌剂研制的瓶颈问题。 

发明内容

本发明的目的在于通过对MRSA细胞分裂的关键蛋白——丝状温度敏感蛋白Z（flamentous temperature-sensitive protein Z，FtsZ）的结构基因ftsZ mRNA为靶点进行研究，提供一种透膜肽介导的反义抗菌剂及其制备方法和应用。 

本发明的目的是这样实现的： 

一种透膜肽介导的反义抗菌剂，包含(KFF)₃K-Cys-SMCC-C₆-LNA787，所述的(KFF)₃K-Cys-SMCC-C₆-LNA787为透膜肽(KFF)₃K与LNA787之间以半胱氨酸-〔4-(N-马来酰亚胺甲基)-1-环己酰胺〕-己烷进行连接； 

所述LNA787的序列为5'-T+*GA+CT*C+GCC*A+C+CA*GTAA*TA+T+*T-3'，其中A为腺嘌呤核苷酸单体，T为胸腺嘧啶核苷酸单体，C为胞嘧啶核苷酸单体，G为鸟嘌呤核苷酸单体；*X代表硫代修饰，X+代表LNA修饰，X为A、T、C或G； 

所述硫代修饰的核苷酸如式（Ⅰ）所示，所述LNA修饰的核苷酸结构中2′-O位和4′-C位通过缩水作用形成氧亚甲基桥，并连接成环形，如式（Ⅱ）所示： 

所述透膜肽(KFF)₃K的序列为5'-KFFKFFKFFK-3'，其中K为赖氨酸，F为苯丙氨酸。