[发明专利]乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种检测乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR试剂盒，适用于各种组织、细胞、血液及其它体液中的乙型肝炎病毒核酸的定量检测。

背景技术

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染不仅引起急慢性病毒性肝炎，而且与肝纤维化、肝细胞癌密切相关，是一个严重危害全世界人类健康的公共卫生问题。全球约20亿人被证明有乙肝感染，3.5亿人为慢性感染者，据世界卫生组织报道，全球前10位疾病死因中，乙肝占第9位。我国属于世界上HBV感染高发区，全国约1．3亿人是HBV携带者，慢性肝炎患者2300万，占全球HBV表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）总携带率的近50%；60%的人受过HBV的感染，在某些人群中甚至高达79%；8%~10%的人为HBsAg携带者。此外，患慢性肝炎的病人中约有80%以上为慢性乙型肝炎患者，而受HBV慢性感染的人群罹患原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的相对危险性至少增加300倍。据世界卫生组织1983年报告，全世界的原发性HCC中大约80%都与HBV慢性感染相关。每年我国在病毒性肝炎的直接治疗方面费用约有500亿元(不包括保健品费用、影响学习、就业和工作等造成的间接损失)。早期诊断HBV相关指标对控制乙肝蔓延、确立正确治疗方案至关重要。

乙型肝炎病毒属于嗜肝病毒家族，是已知最小的动物DNA病毒之一。HBV基因组结构独特，由不完全的环状双链DNA组成，其两条链核酸的长短不一。在HBV-DNA的长链上有四个开放读码框架（ORF），即S区、C区、P区和X区，分别编码HBsAg、HBcAg、HBeAg、DNA多聚酶和X蛋白。乙肝病毒血清标志物（HBV-M）检测是诊断乙型肝炎最常用的指标,目前临床最常用的“两对半”指的是HBsAg、HBeAg、HBcAb、HBsAb、HBeAb，主要反映人体对乙肝病毒（HBV）感染的免疫状态，但不能直接反映HBV在患者体内的复制情况，更不能作为判断患者是否具有传染性的直接证据。由于HBV感染者不同时期可有多种不同的血清学标志模式，对于这些模式的不同临床意义，非传染病专业医师很难准确掌握。由于HBV是DNA病毒，因此HBV DNA的检测是衡量乙肝传染性的最精确的指标，HBV DNA阳性即反映有完整的病毒颗粒的复制，是判断患者具有传染性的最直接和最可靠的指标，同时，HBV DNA还可作为判定HBV药物疗效的一个极有意义的临床指标。现在临床上主要采用酶联免疫法对HBV表面的免疫标记物进行检测和定量．但是酶联免疫的特异性不高．且灵敏度相对较低．假阴性率高。九十年代后，PCR技术和生物芯片技术已用在乙肝病毒的检测中，大大的提高了检测的准确度，缩短了分析时阀，实现了对HBV DNA的定量检测，可以准确的判断HBV病毒在体内的复制情况，但是这些检测技术还存在各种缺陷，且成本相对较高，不利于普及。因此，开发快速、敏感和特异的检测HBV DNA的技术是未来HBV病原学检测技术的发展方向。

目前常用的HBV DNA定量检测方法有杂交法、PCR（聚合酶链反应）、COBAS Amplicor技术和bDNA等技术。使用COBAS Amplicor检测HBV DNA是国际公认的PCR定量方法的金标准，具有良好的准确性和重复性。其主要特点是：由于采用了内对照，能有效地监控病毒核酸的抽提、扩增的效率，能够消除反应体系中干扰因素的影响，因此可以比较客观地反映标本初始状态时靶核酸的含量。但由于其配套试剂极其昂贵，很难在临床实验室推广使用。bDNA在HBV DNA定量测定中线性范围的下限较高，因而其临床应用价值也有限。

杂交法是基于核酸分子组成的碱基可通过配对互补结合。带有标记物的DNA或RNA片段能与互补的核酸序列特异结合，这种片段称为核酸探针。HBV的核酸探针有DNA探针和RNA探针两种。核酸探针法的主要特点是敏感性、特异性都较强，但检测灵敏度低。