[发明专利]青石斑鱼B淋巴细胞刺激因子基因与蛋白质的制备及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及青石斑鱼BAFF基因克隆、表达、蛋白纯化及活性鉴定技术。

背景技术

肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)成员生物学效应包括促进细胞生长、分化、凋亡及炎症诱发等功能，在淋巴器官的形成，免疫细胞的激活及维持机体的稳态方面发挥重要的生物学作用。近年来，很多具有重要功能的TNFSF被发现，B 淋巴细胞刺激因子（B lymphocyte stimulator, BLyS）,又称TALL-1(TNF-and ApoL-related leukocyte expressed ligand 1)、BAFF（B cell activating factor belonging to the TNF family）、THANK(TNF homologue that activates apoptosis、NF-ΚB and JNK), 属于肿瘤坏死因子（TNF）家族，有研究表明人体内BAFF的水平对维持机体免疫系统的“稳态”（homeostasis）非常重要，人BAFF表达缺陷将极大地降低人体免疫力，BAFF作为在人体免疫系统中起重要调控作用的一种特异的细胞因子，其活性的充分表达能够很好地加强机体的自身免疫能力，直接或间接地提高体内BAFF的水平将有助于对免疫缺陷疾病进行治疗，BAFF的重大理论意义和临床医学应用价值在国际上引起了高度重视。

鉴于鱼类所处的进化地位以及水产养殖业的高速发展，鱼类免疫系统日益为人所关注。对鱼类免疫系统的研究不仅为高等生物免疫演化途径提供重要的参考，同时也为日趋严重的鱼类养殖的病害防治提供必要的免疫理论与应用基础。鱼类与哺乳动物在免疫器官组成上不同，肾脏和脾脏是其主要的免疫器官，因此，我们推测与免疫相关的细胞因子TNF家族的成员在鱼类免疫中有重要作用。

石斑鱼是重要的世界性海产经济鱼类，本课题基于国内外研究的现状以及石斑鱼的细菌感染相关疾病的思考，提出对石斑鱼BAFF基因进行分子结构、功能及免疫调节机制方面进行研究，针对免疫力低下和炎症感染疾病的鱼类，有望开发成相关的免疫增强剂和疫苗佐剂。

发明内容

   本发明针对现有技术的不足，提供一种从中青石斑鱼中获得B淋巴细胞刺激因子（BAFF）cDNA，并提供青石斑鱼BAFF蛋白的表达及纯化方法和活性检测。

本发明所述青石斑鱼B淋巴细胞刺激因子（BAFF） cDNA，序列如SEQ ID NO.1所示

青石斑鱼BAFF cDNA的克隆方法如下：

(1) 提取青石斑鱼脾脏组织总RNA，SMART^TM RACE 试剂盒(TaKaRa)逆转录为第一链cDNA；

(2) 设计引物扩增该基因的中间片段：

正义寡核苷酸引物：Ea-M-F：5’- TCAGAGGTGTGTCGCAGGAGA -3’(SEQ ID NO.5)

反义寡核苷酸引物：Ea-M-R：5’- TCCTGTGAAGCAGGTGTTGTA -3’(SEQ ID NO.6)

(3) 根据中间片段序列设计引物扩增该基因的3’端：

3’端正义寡核苷酸外引物：GSP-U3’ 5’-GATGCGTTGACCCTGACAAG GAATAGA AGG-3’ (SEQ ID NO.7)

 3’端正义寡核苷酸内引物：GSP-N3’ 5’-GGCAGGCTGGGCTGA GGAGAGGCTCT-3’ (SEQ ID NO.8)

3’端反义寡核苷酸引物：UPM 5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ (SEQ ID NO.9)

(4) 根据中间片段序列设计引物扩增该基因的5’端：

5’端正义寡核苷酸引物：UPM 5’-CTAATACGACTCACTATAGGG CAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ (SEQ ID NO.9)

5’端反义寡核苷酸外引物：GSP-U5’ 5’-AGGGGATACCTGTGTGTG GCTCCGACTT-3’ (SEQ ID NO.10)

5’端反义寡核苷酸内引物：GSP-N5’ 5’-GAGTCCCAGGTTGG TGCAGAGGCTCTT-3’ (SEQ ID NO.11)