[发明专利]一种偶联原位萃取樟芝活性产物Antrondin C的双液相发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种樟芝活性产物Antrondin C的发酵方法，特别是将调节细胞通透性的液态发酵与原位萃取相结合，建立合适的双液相耦合萃取发酵体系，属于发酵工程领域。 

技术背景

樟芝（Antrodia camphorata）亦名牛樟菇、红樟芝，是一种中药界极端珍贵的食药用菌菇类，其子实体仅寄生于台湾特有树种牛樟树的中空心木材内壁，具有浓郁的樟树香气。 

在过去的数年间，由于樟芝广泛的药理活性以及低毒性特质，使其在国际间渐渐受到关注，而由其萃取出具有药效的天然物也被各方学者及业界所重视，现今已有众多研究单位投入人力与物力，致力于樟芝菌活性成分的研究。樟芝人工培育大致可以分为椴木栽培法、固体培养法、液体发酵法三种，其中“椴木栽培法”获得的子实体与野生樟芝成份组成基本一致，但椴木栽培法生长周期长，产量低，难以弥补市场的巨大需求；若将樟芝菌种以太空包进行固态培养，太空包含有纤维物、醣类、五谷杂粮类等，培养成本较高；而目前通过樟芝细胞深层液态发酵已经成功地实现了樟芝菌体快速的人工培养，因此液态发酵生产樟芝活性产物将是一种有效地方法。 

台湾、日本方面文献有报道，樟芝液态发酵得到的生理活性产物除了多糖、三萜类等常见的物质外，Nakamura等人在樟芝液态发酵的菌丝体中还分离出5种生理活性产物马来酸和琥珀酸衍生物（Antrondin A-E），其中Antrondin B和Antrondin C具有抑制肺癌LLC细胞的药效，而在其他药效的研究中，发现生理活性产物Antrondin A-E对于抗肝脏发炎方面也具有相当好的疗效，所以该类生理活性产物应用前景广阔。但是国内外关于液态发酵法生产并提高这些生理活性产物产量的研究非常少，特别是在樟芝液态发酵合成活性产物Antrondins的发酵调控方面。 

目前公开号为CN 102321684 A（一种促进樟芝活性产物Antrondin C生物合成的发酵方法）等专利文献公开了樟芝固态发酵通过代谢调控提高Antrondins类化合物的产量，或是樟芝液态发酵通过代谢调控提高三萜类或多糖类物质等内容，并没有关于樟芝液态发酵合成活性产物Antrondins类化合物的专利文献报道，也没有通过调控液态发酵提高活性产物Antrondins类化合物产量的方法专利报道。 

在常规液态发酵法中，樟芝液态发酵合成活性产物Antrondins类化合物产量很低，难以实现工业化生产，所以如何有效地提高樟芝活性产物的产量已成为该领域的研究热点。 

发明内容

本发明针对樟芝常规液态发酵合成的生理活性产物产量低和种类少等问题，提供一种采用表面活性剂偶联原位萃取发酵生产樟芝活性产物的双液相耦合发酵方法，先利用表面活性剂改变细胞膜的通透性，降低樟芝生理活性产物的负反馈抑制作用，可以有效地提高樟芝生理活性产物的种类与产量，而在发酵过程中由于此类产物难溶于水，所以从胞内分泌出来依然附着在菌球表面的活性产物可以通过萃取剂萃取富集到萃取剂相中，从而在同一发酵周期内实现樟芝活性产物的高效合成与萃取，萃取剂相中活性产物通过乙醇萃取到乙醇相中，使得樟芝生理活性产物的提取纯化简便，回收的萃取剂经过蒸馏除去残余乙醇后可以重复利用，从而降低了生产成本。 

为达到发明目的，本发明采用以下技术方案： 

樟芝（Antrodia camphorata）菌种经过液体种子培养基扩大培养，以一定的接种量接于液体发酵培养基中，在转速为80～180转/分钟，温度22～34℃条件下，发酵培养8～12天，在发酵过程中采用添加不同种类表面活性剂及萃取剂，建立调节细胞通透性耦合原位萃取的双液相发酵体系，降低生理活性产物负反馈抑制的强度，提高樟芝活性产物产量。其中所用液体发酵培养基为：葡萄糖50～100g/L，黄豆粉5～15g/L，玉米浆粉2～6g/L，硫酸镁0.1～1.5g/L，磷酸氢二钾0.1～1.5g/L。 

所用表面活性剂为Span系列、Tween系列、曲拉通、PEG系列、皂角等，能够改变樟芝细胞膜的通透性，其中优选Span-80。 

按照本发明优选的技术方案，表面活性剂Span-80的添加时间为樟芝液态发酵开始后24～96小时，其添加比例为0.1%～15%。 

所选用萃取剂种类有油酸等长链不饱和脂肪酸及壬烷、辛烷、十二烷等长链烷烃类，该类萃取剂本身对菌体毒性较小，且难溶于水，可将附着在樟芝菌球表面活性产物萃取富集到萃取剂相中，以降低高浓度的胞外产物对其分泌的抑制作用，大幅度提高樟芝液态发酵合成活性产物的效率，其优选十二烷。