[发明专利]上皮型钙黏蛋白表达基因CDH1 pre-mRNA选择性剪接检测试剂盒及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种CDH1基因pre-mRNA选择性剪接检测试剂盒，特别涉及其在东亚胃癌高发人群的mRNA 表达分析与后果评估。

背景技术

CDH1 基因位于人类染色体16q22. 1，正常转录的mRNA产物长度为4875bp, 包含16个外显子，编码包含882氨基酸的上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）。CDH1基因所编码的钙粘蛋白是一种Ca⁺⁺依赖性的上皮细胞间的粘附分子，其表达量的下调预示着人类肿瘤的强侵袭性和不良预后，这在胃癌中表现得尤为明显。已经知道，基因转录的pre-mRNA通过剪接过程得到成熟的mRNA，剪接识别信号的异常活化或者沉默，将干扰正常的剪接过程，形成长度和构成异常的mRNA，这些异常的mRNA可能由于无义介导的缺失而降解，或者编码截短型的蛋白质，干扰全长E-cadherin的功能。因此，剪接体异常在胃癌形成中具有重要作用。但是目前尚缺乏检测CDH1基因剪接体异常的系统方法。因此有必要开发一种方便快捷的CDH1基因pre-mRNA选择性剪接检测方法，以用于胃癌的病因学分析及患者预后评判。

发明内容

本发明的目的是提供一种CDH1基因pre-mRNA选择性剪接检测试剂盒及其应用。

本检测试剂盒主要包括以下成分：

(1) CDH1基因cDNA PCR扩增与测序引物7对，各对引物序列见表1；

（2）逆转录酶， PCR扩增试剂，如dNTP、Ex Taq Hot Start 聚合酶等。

                                                 

 本试剂盒扩增出的PCR产物可以采用以下方式进行mRNA表达检测：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带位置进行分析，并对于电泳条带纯化后测序分析。

试剂盒中，还可以有琼脂糖凝胶、DNA纯化试剂等。

本发明所说的试剂盒用于检测CDH1基因pre-mRNA选择性剪接产物。

本试剂盒的检测选择性剪接步骤包括：

（1）    提取样本外周血或组织RNA。 

（2）    RNA逆转录。

（3） CDH1基因cDNA PCR扩增。

在7个重叠区域扩增CDH1基因编码区，分别是5’UTR–外显子3、外显子4–6、外显子5–8、外显子7-10、外显子10–13、外显子12-15及外显子14–3‘UTR。引物如表1所示。反应体系为20μl ：TaKaRa Ex Taq HS 聚合酶0.2ml、10×EX Taq buffer 2ml、dNTP Mixture（2.5mM each）2ml、上游引物（10μM）1μl、下游引物（10μM）1μl、cDNA 1.5μl 、ddH₂O 12.3ml。反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30sec，60℃左右（相应退火温度）复性30sec，72℃延伸30sec，40个循环；再72℃延伸10min，4℃保存。

（4）将PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB分辨条带，通过条带差异区分野生型或外显子跳跃型。条带经切胶纯化测序鉴定。 

本试剂盒具有高效的选择性剪接检测作用。实施实例1中报道，对于胃癌患者，针对CDH1基因外显子7-10区域，采用试剂盒的功能评估方法提出，除了正常剪接的mRNA产物，还存在CDH1外显子9跳跃及外显子8处83bp缺失的选择性剪接产物，对于胃癌形成可能具有病因学意义。实施实例2中报道，针对CDH1基因外显子5的突变c.604G>A(V202I)开展RNA层面的功能后果评估，采用试剂盒的评估方法提出该突变未引起外显子跳跃，可能对胃癌形成不具有病因学意义。本试剂盒在胃癌患者选择性剪接与突变的病因学意义评估上具有重要作用。

附图说明

图1是胃癌患者T278瘤组织（T）及癌旁正常组织（N） RT-PCR图：图示CDH1基因外显子7-10的扩增条带。M为分子量标记。

图2 是图1中截短条带1的测序图：图示CDH1基因外显子8缺失后段83bp的序列。

图3 是图1中截短条带2的测序图：图示CDH1基因外显子9跳跃的序列。