[发明专利]一种施罗氏弧菌多重毒力因子GeXP快速检测试剂盒和检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种专用于可导致珊瑚发生白化现象的病原弧菌—施罗氏弧菌(Vibrio shilonii)的快速检测试剂盒和检测方法。

背景技术：

施罗氏弧菌(Vibrio shilonii)是一种海洋弧菌，能够侵染珊瑚，引起珊瑚的细菌性白化。目前，施罗氏弧菌的检测方法主要是传统的微生物分类鉴定方法及依赖于PCR技术的检测方法。传统的微生物分类和鉴定方法主要是以微生物的形态学和生理生化等特性作为判断依据，虽然结果可信度高，但是繁琐且费时。现阶段采用最多的还是分子生物学的方法，其主要依赖于PCR技术对某些特异性的基因进行扩增。可是这些方法都存在一定的缺陷：(1)检测耗时，过程繁琐；(2)检测灵敏度低，检测出病原菌时往往是发病晚期；(3)检测的目标基因过于单一，容易漏检由于环境差异导致的同种不同菌株，不能全面反应该种病原菌的潜在致病性。因此，在做病原细菌的检测时，只有同时检测尽可能多的特异基因，才能使检测结果更加具有可靠性，对病原细菌的鉴定更加准确。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种更为快速准确地评价施罗氏弧菌(Vibrio shilonii)致病性的施罗氏弧菌多重毒力因子GeXP快速检测试剂盒。

本发明的施罗氏弧菌(Vibrio shilonii)多重毒力因子GeXP快速检测试剂盒，包括PCR反应试剂，多基因PCR引物和GeXP多重扩增反应试剂，其特征在于，所述的多基因PCR引物包括13对多基因PCR引物和一对通用引物，具体如下：

含有荧光标记的通用引物对序列，可按常规技术将荧光标记加到下述通用引物序列上，所述的荧光标记优选为CY5荧光标记：

TY-F:5’-AGGTGACACTATAGAATA-3’

TY-B:5’-GTACGACTCACTATAGGGA-3’

为毒力基因sod(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH01000140.1)设计的引物，扩增片段大小约为110bp：

sod-F：AGGTGACACTATAGAATA CCGTTCATGTAGTCTGGACG

sod-R：GTACGACTCACTATAGGGA GCAGCGACTCCACTAACAGA

为毒力基因fldA(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH01000151.1)设计的引物，扩增片段大小约为117bp：

fldA-F：AGGTGACACTATAGAATA ACGTGACATCGTTGAAGCAA

fldA-R：GTACGACTCACTATAGGGA AGGCCAACGAATTGTGACTC

为毒力基因ompUL(GenBank:EU727214.1)设计的引物，扩增片段大小约为124bp：

ompUL-F：AGGTGACACTATAGAATA TTGGTGCGGGTTATCAGCTA

ompUL-R：GTACGACTCACTATAGGGA CGAATACGGTCTGTTAGGTCG

为毒力基因toxS(GenBank:EU727211.1)设计的引物，扩增片段大小约为131bp：

toxS-F：AGGTGACACTATAGAATA CGCGGATATATTCACCACCT

toxS-R：GTACGACTCACTATAGGGA CAATGAATGGCAATCCAACA

为毒力基因Bcp(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH01000011.1)设计的引物，扩增片段大小约为138bp：

Bcp-F：AGGTGACACTATAGAATA AACGTTGTGAGCGTCAAGC

Bcp-R：GTACGACTCACTATAGGGA GGCAACACCGTCACACTACA

为毒力基因dnaJ(GenBank:AB263067.1)设计的引物，扩增的片段大小约为145bp：

dnaJ-F：AGGTGACACTATAGAATA ATTCGGTGATATCTTTGGCG

dnaJ-R：GTACGACTCACTATAGGGA CTCAACGAGCGTTGGAACTT

为毒力基因mshA(GenBank:NZ_ABCH01000011.1)设计的引物，扩增片段大小约为152bp：