[发明专利]植物抗/耐草甘膦基因及其应用

说明书

技术领域

    本发明属于植物分子生物学与植物遗传工程领域，具体地说，本发明涉及三种植物源抗/耐草甘膦基因以及该基因编码的蛋白质。通过遗传转化的方法使该基因在植物中表达而使植物获得对草甘膦的抗性能力，从而可以利用草甘膦于作物田间选择性地防除杂草。本发明也可以运用在作物育种、植物细胞培养的筛选。 

背景技术

    草甘膦（glyphosate)分子式为C₃H₈NO₅P，是一种高效、广谱、低毒、低残留、不破坏土壤环境、对大多数植物具有灭生性的除草剂。具有对人畜无毒，自然条件下杂草和农作物对它产生抗性的频率较低，低土壤残留量等特点，市场潜力巨大。 

草甘膦毒性作用机理主要是竟争性抑制EPSP合酶即5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)，该酶广泛存在于真菌、细菌、藻类、高等植物体内，但不存在于动物体内。草甘膦是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的类似物，二者的分子式极为相似，它能与PEP竞争性结合EPSP合酶，形成EPSP合酶·3-磷酸莽草酸(S3P)·草甘膦的复合物，阻断EPSP的合成，从而阻断芳香族氨基酸的合成，导致植物死亡。 

然而草甘膦无选择性地杀死作物和杂草，限制了它在农业生产上的使用，因此为了能够在农作物生长期间应用草甘膦选择性地除草，农作物需要获得具有抗/耐草甘膦的能力。 

尽管草甘膦能抑制大部分植物和细菌中芳香族氨基酸合成过程中5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶（EPSPS），但已发现部分细菌的EPSPS对草甘膦不敏感，被分离出来，生产实践中也发现有些植物具有对草甘膦的耐药性。通过转基因表达细菌或有草甘膦抗性植物的EPSPS基因而获得抗/耐草甘膦的能力。农杆菌CP4和Salmonella typhimuriumCT7的EPSPS在植物中表达而获得的抗性已在生产中应用（美国专利453590，4769061，5094945）。抗草甘膦Pseudomonas putida、Zymomonas mobilis以及Klebsiella pneumoniae等EPSPS基因也申请了专利保护。在植物中也发现了由于EPSP合酶单个氨基酸位点突变造成其对草甘膦具有抗药性。马来西亚的牛筋草、澳大利亚的瑞士黑麦草和智利的多花黑麦草对草甘膦的抗药性即是草甘膦靶标酶EPSPS基因106位氨基酸由脯氨酸突变为丝氨酸或苏氨酸所致(Powles,2006)。抗草甘膦牛筋草EPSPS的编码基因发生了变化，牛筋草敏感生物型EPSPS基因的第319个核苷酸碱基为胞嘧啶C，而抗性生物型中突变成了胸腺嘧啶T，使第106位脯氨酸变为了丝氨酸（Baerson et al.,2002）。Ng等发现抗性生物型中同时存在胞嘧啶C突变成了鸟嘌呤A，导致其第106位脯氨酸变为苏氨酸（NG et al,2003）。另外还有多个位点的甘氨酸被天门冬氨酸、苏氨酸被丙氨酸、脯氨酸被亮氨酸取代的例子，说明EPSPS存在多个与PEP结合的活性位点。通过这些有效位点的基因突变，降低了EPSPS对草甘膦的亲和性，从而增强了杂草对草甘膦的抗性。孟山都公司已经对抗草甘膦牛筋草的EPSPS基因申请了专利保护。但是为了提高转基因农作物的抗性水平和增加抗性基因的多样性，生产应用中仍然需要新的抗/耐草甘膦基因和以此为基础的抗/耐草甘膦植物。 

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种基于自然界的植物天然耐性为基础，经过前期对大量植物进行的草甘膦耐性筛选得到的新的抗/耐草甘膦基因。 

为了达到上述目的，本发明提供了三种具有草甘膦耐性的基因（LsEPSPS）LsEPSPS1、 LsEPSPS2和LsEPSPS3，核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5。 

利用上述LsEPSPS1、LsEPSPS2和LsEPSPS3三种核酸序列，可以用来人工引入一个或多个变异，然后通过草甘膦筛选变异分子，而获得保持有抗/耐草甘膦能力的变异分子。例如利用低保真PCR的方法可以产生很多LsEPSPS1、LsEPSPS2和LsEPSPS3的变异分子，而这些变异分子可以通过草甘膦筛选获得继续保持有抗/耐草甘膦能力的变异分子。 

本发明还提供了一种抗/耐草甘膦蛋白质多肽，该抗/耐草甘膦蛋白质多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或与上述氨基酸序列相比具有不小84%相同性的氨基酸序列。