[发明专利]一种膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原制备的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人工抗原的制备方法，具体涉及一种膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原制备的新方法，属于抗原制备技术领域。

背景技术

贝类大量摄食有毒藻类而在体内积累的四氢嘌呤毒素。分为四类：氨基甲酸酯类毒素，膝沟藻毒素，N-磺酰氨甲酰基类毒素，脱氨甲酰基类毒素，脱氧脱氨甲酰基类毒素。毒性很强，摄入1mg就可致人死亡，其化学性质非常稳定，烹调加热不能消除其毒性，其毒性对人类的安全产生了一定的影响。

同时由于水体富营养化致使藻类异常增殖，并释放藻毒素( Algae Toxin)， 这些次级代谢产物严重危害了人类的用水安全和其他水生生物的安全，其中以膝沟藻(gonyautoxin， GTX ） )产生的麻痹性贝类毒素引起更多重视，膝沟藻毒素为麻痹性贝类毒素家族中重要的成员，目前已经发现膝沟藻毒素各种异构体有60 多种更应该。膝沟藻毒素2，3（ gonyautoxin，GTX2，3) 是我国南方沿海染毒贝类和有毒赤潮藻的麻痹性贝毒的主要成分之一。互为空间异构体的GTX2 和GTX3，由于相对分子量小（396.36 Da）、毒性大，不具备完全抗原特性。其分子结构复杂，虽有较多官能团，但活性都不高。

小鼠生物测试法是常用的检测麻痹性贝毒的方法。但此种方法不能确知毒素的组成及含量，且重复性差，灵敏度不高。近几年发展起来的HPLC 法具有灵敏、高效的特点，但成本高，费时，需要较高的仪器设备及分析技术。酶联免疫吸附测定技术（ELISA）具有简便、快速、灵敏、成本低廉等特点，是目前最有前途的检测麻痹性贝毒技术。近十多年来，人们用多种方法试图开发出用于不同生物毒素检测的可靠的免疫诊断试剂盒。Johnson 等1964 年首次成功制备了抗STX 的多克隆抗体，Adachi M 等人尝试用单克隆抗体技术现场监测产麻痹性贝毒的有毒藻。近年有关麻痹性贝毒（特别是石房蛤毒素STX）的免疫学测定方法已取得了重大进展，初步建立了麻痹性贝毒的放射免疫测定技术和酶联免疫吸附测定技术（ELISA）。由于危害大，结构较复杂，其全合成至今尚未成功。又很难直接从天然资源中分离纯化毒素，毒素纯化不易、价格昂贵、偶联难度大、免疫易造成动物中毒等原因，仅加拿大、日本等少数发达国家掌握了此技术，但国内外对这方面的报导甚少。膝沟藻毒素GTX2,3引起的麻痹性贝类毒素免疫学快速检测试剂盒至今没有普及应用的关键问题在于，该毒素购买价格昂贵，提取困难，同时因其热和碱性不稳定性，而且GTX2,3分子结构复杂，众多官能团活性低，因此与载体蛋白偶联难度大、免疫易造成动物中毒。本研究旨在攻克免疫学快速检测的第一关GTX2,3人工抗原的制备。

关于GTX已经有相关的文章发表，可是还没有人工抗原制备地详细报道，同时文献中都是GTX-BSA-甲醛，而根据本发明的设计思路，及实验结果表明，只有GTX-醛类-载体蛋白才能有效地偶联，这也是目前GTX免疫学快速检测试剂盒欠缺的最大瓶颈问题。所以研究GTX-醛类-载体蛋白具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原制备的新方法。

为实现上述发明的目的，本发明采取的技术方案如下：

该方法是利用膝沟藻毒素GTX_2,3与载体蛋白BSA及KLH大分子偶联制备人工抗原的方法，用乙二醛在半抗原分子GTX_2,3第2号和8号位亚氨位上引进2个自由的氨基，再用2步法将此中间产物( H₂N- GTX2,3) 分别与载体蛋白BSA 和KLH 偶联.具体方法如下：

(1)  均取85μL 的2.37mg.mL^-1 GTX2,3毒素原液在避光下加入少量0.1M醋酸溶液，并加入一定量的0.1M醋酸钠溶液，轻弹混匀，使得溶液的pH值为4.6；

(2) 向(1)溶液中分别加入适量新鲜配制的乙二醛， 使醛的终浓度为0.1～3%；

(3) 称取0.0023 g BSA、0.0023 g KLH 分别溶于160 μL 0.01 mol·L^-1 pH7.6的PBS 中， 分别加入上述溶液中；使GTX：BSA的摩尔比为3～20，GTX：KLH的摩尔比为5～25；

（4）25℃反应20～80h后转入4℃冰箱反应10～30 h，即先将GTX2,3活化；