[发明专利]利用双链RNA干扰技术制备降低烟草烟碱合成的抑制剂的方法及其应用

权利要求书

1.一种利用双链RNA干扰技术制备降低烟草烟碱合成的抑制剂的方法，它包括以下步骤：

1）提取烟草的RNA，反转录得到烟草腐胺-N-甲基转移酶基因的cDNA；

2）利用PCR技术，以烟草腐胺-N-甲基转移酶基因的cDNA为模板，得到的烟草腐胺-N-甲基转移酶基因片断；

3）将步骤2）中烟草腐胺-N-甲基转移酶基因片断连接到T载体上；

4）将步骤3）中T载体上烟草腐胺-N-甲基转移酶基因片断连接到质粒载体PET-21a上，得到重组质粒PET-EH；

5）将步骤4）中得到重组质粒PET-EH转入到缺失RNAE3酶的大肠杆菌细胞中，

6）将步骤5）中大肠杆菌细胞进行筛选，等到转化子；

7）将步骤6）中转化子在LB液体培养基中扩大培养；

8）将扩大培养的转化子采用超声波破碎，得到含有发卡dsRNA的破碎细胞溶液，即为dsRNA粗制剂；

9）向步骤8）中dsRNA粗制剂中依次加入与dsRNA粗制剂溶液重量比为2~5%的甘油、0.01~0.1%的色氨酸和1~2%的聚乙二醇醚，然后搅拌均匀后分装，即可得到降低烟草烟碱合成的抑制剂，所述抑制剂中dsRNA浓度为25~40μg/mL。

2.根据权利要求1所述的利用双链RNA干扰技术制备降低烟草烟碱合成的抑制剂的方法，所述步骤2）中，烟草腐胺-N-甲基转移酶基因片断的长度为300~800bp。

3.一种根据权利要求1所述降低烟草烟碱合成的抑制剂的应用，其特征在于：所述抑制剂以5~15mL/株施于烟草上。