[发明专利]一种广谱抗人p21Ras蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株KGH-R1及单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明属于医学生物学领域，尤其涉及一种广谱抗人Ras蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株KGH-R1及单克隆抗体。 

背景技术

Ras基因是一种重要的细胞原癌基因，其命名来自大鼠肉瘤的英文rat sarcoma。Ras基因家族包括三个主要成员，即H-Ras、K-Ras和N-Ras，分别定位于第12、11和1号染色体，编码由188-189个氨基酸组成的分子量约为21KD的蛋白质，即p21Ras蛋白，三种p21Ras蛋白的氨基酸序列约有85%的同源性。p21Ras蛋白作为极其重要的信号转导传递蛋白调节细胞的正常分化和增殖。 

p21Ras蛋白定位于细胞膜的内侧面发挥其生物学功能。p21Ras蛋白有自身GTP水解酶活性，可分别与GTP和GDP结合形成一种分子开关机制。p21Ras蛋白在细胞外生长信号刺激下与GTP结合成为活性状态的p21Ras-GTP形式，从而激活Ras蛋白下游众多信号通道，促进细胞分裂、增生，抑制细胞凋亡，使细胞间接触抑制减弱；而其在GTP酶激活蛋白水解下变成与GDP结合的非活性状态。 

当Ras基因发生突变、p21Ras蛋白过表达或Ras上游生长因子受体活化时均可导致细胞恶性转化并促进恶性肿瘤细胞的浸润和转移。研究表明，大约30%的人类肿瘤中存在Ras基因突变或Ras蛋白过表达，部分学者认为Ras蛋白主要在肿瘤形成的早期阶段充当重要角色。 

目前国内尚未有国产化的Ras蛋白抗体，而国外的商品化抗体多是针对三种Ras蛋白的共同区域合成多肽为免疫原制备的，这样筛选出来抗体是针对多肽序列的，且国外抗体价格通常较贵，也限制了该蛋白在临床检测中的推广应用。另外，蛋白质发挥其生物学功能是要通过折叠形成一定空间构象的，那么针对多肽序列所产生的抗体就会发生由于Ras蛋白在折叠过程中形成空间位阻，导致抗体与抗原决定簇的结合能力下降；抗体所拮抗的抗原决定簇在蛋白质折叠过程中折叠进蛋白内部不能暴露于蛋白质表面，从而不能与活性状态的Ras蛋白结合的情况。 

发明内容

本发明目的是提供一种广谱抗人p21Ras蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株KGH-R1及其抗体，该抗体能用于ELISA、Western、免疫组织化学检测Ras蛋白，同时可为后续的Ras细胞内抗体的制备奠定基础。 

本发明的一种广谱抗人p21Ras蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株KGH-R1，于2011年9月23日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址为中国武汉武汉大学），保藏号CCTCC NO：C201197。 

所述的广谱抗人p21Ras蛋白的单克隆抗体，其特征在于该抗体是将分泌广谱抗p21Ras蛋白的交瘤细胞株KGH-R1，1×10⁶个注射入预先经灭菌液体石蜡处理过的Balb/c小鼠腹腔内，然后待腹水足够多而小鼠处于濒死前抽取腹水，并将腹水离心收集上清获得的。 

本发明中，用基因合成和RT-PCR方法得到Ras基因的CDS区全长序列，通过构建重组质粒，原核表达重组Ras蛋白，Ras蛋白复性后作为免疫原免疫小鼠，并取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0进行细胞融合，通过三种Ras蛋白的ELISA鉴定得到的。该杂交瘤细胞分泌的抗p21Ras抗体类型为IgG2b、κ。 

本发明中所参考的人H-Ras、K-Ras、N-Ras基因序列在GeneBank的登记号分别为NM_005343、M54968和BC005219。 

本发明中K-Ras、N-Ras基因的全蛋白表达序列（CDS）通过人工合成方式获得。H-Ras的CDS区全长序列是从肝癌细胞株7703（来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）中由RT-PCR方法获得，扩增基因引物序列为，正义链：5'-GGATCCAGAGGAGCGATGACGGAATATA-3'，上游引入BamHⅠ酶切位点，反义链：5'-AAGCTT GGTGGCATTTGGGATGTTC-3'，下游引入 HindⅢ酶切位点，原核表达载体为PET-28a（+）。