[发明专利]基于超分支滚环扩增的核酸试纸条检测食品致病菌的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种基于超分支滚环扩增的胶体金核酸试纸条检测食品致病菌的方法及检测单增李斯特菌和沙门氏菌的试剂盒。 

背景技术

近年来，食源性致病菌以其传染性和致病性，在全球范围内造成了越来越多的食品安全事件，随着人们的生活水平和接受教育水平的不断提高，食品安全越来越受到人们的广泛重视，食品致病菌问题也相应地更加备受关注。快速、高特异性、高灵敏度的检测食品致病菌的方法不仅可以快速诊断致病的原因，在现实生活中还能预防肠道传染病和食物中毒的发生。 

目前食源性致病菌的检测方法主要依靠分离培养和生化鉴定，该方法费时费力。而灵敏度更高、特异性更好的基于核酸的检测方法，虽然可以直接用于细菌检测而不需要前期培养或者缩短孵育时间，但是需要温度循环和昂贵的设备，例如聚合链式酶反应（PCR）和基于核酸扩增的荧光检测技术。随着胶体金诊断技术的发展，一种检测速度快、特异性好、灵敏度高、设备简单、成本低、操作简单的胶体金免疫试纸条在生物医学领域特别是医学检验中，得到了广泛应用，早孕试纸条成功的商品化应用就是证明，但是胶体金免疫试纸条所用的单克隆抗体也比较昂贵，针对不同的检测样品，需要调整抗体的类型，不适于广谱性检测。近期，一种基于核酸检测的核酸试纸条发展迅速，它与恒温扩增的方法相结合用于检测，已有环介导的恒温扩增核酸试纸条（LAMP-NALFTS），基于核酸序列的核酸试纸条（NASBA-NALFTS），交叉引物恒温扩增核酸试纸条，循环探针温扩增核酸试纸条（CPT-NALFTS），重组聚合酶温扩增核酸试纸条（RPA-NALFTS），链置换恒温扩增核酸试纸条（SDA-NALFTS）等方法的报道，但是普遍存在探针设计复杂，检测灵敏度相对不高，易出现假阳性等问题， 且在食源性致病微生物检测领域的应用较少。 

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于超分支滚环扩增的胶体金核酸试纸条进行简便、灵敏度高、探针设计简单、操作步骤简短及特异性高的检测食品致病菌的方法。 

本发明的另一目的在于提供一种使用上述方法实现检测单增李斯特菌和沙门氏菌的试剂盒。 

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于超分支滚环扩增的胶体金核酸试纸条检测食品致病菌的方法，具体包括如下步骤： 

（1）食品致病菌基因组DNA的提取及酶切 

提取食品致病菌的基因组DNA，根据食品致病菌的保守序列选择限制性内切酶对食品致病菌的基因组DNA进行酶切反应得到靶片段。 

（2）扩增引物及核酸探针序列设计 

根据步骤（1）得到的靶片段序列设计一条5’端磷酸化修饰的锁式探针（padlock probe）； 

根据锁式探针序列设计两条扩增方向相反的引物1和引物2，引物1和引物2的5’端修饰有功能基团； 

设计一条与锁式探针互补的5’端含多聚A尾的单链DNA，作用是使其与超分支滚环扩增的双链产物退火杂交，为试纸条上核酸杂交提供空闲碱基位点； 

设计一条5’端修饰有功能基团的多聚T探针； 

设计一条5’端修饰有功能基团的多聚A捕捉探针。 

（3）超分支滚环扩增反应 

连接反应：反应体系包括步骤（1）中所述的靶片段、步骤（2）中所述的锁式探针、连接酶及其缓冲液和双蒸水； 

消化反应：反应体系包括上述连接反应的产物、核酸外切酶及其缓冲液和双蒸水；

扩增反应：反应体系包括上述消化反应的产物、步骤（2）中所述的引物1和引物2、dNTP、聚合酶及其缓冲液和双蒸水。

（4）退火杂交 

将超分支滚环扩增反应产物与步骤（2）中所述的5’端含多聚A尾的单链DNA退火杂交。 

（5）纳米金探针的制备 

纳米金的制备：用柠檬酸盐还原法以氯金酸（HAuCl₄）为原料制备纳米金； 

纳米金探针的制备：将步骤（2）中所述的多聚T探针与纳米金连接制备纳米金探针，并用包埋缓冲液重悬纳米金探针得到用于包埋的纳米金探针。 

（6）胶体金核酸试纸条的制备