[发明专利]一种高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的方法。

背景技术

随着糖尿病、肥胖症等病症的发病率的不断升高，人们对饮食健康越来越关注，并尽量避免高脂高能量食物的摄入。蔗糖是传统的甜味剂，但其能量较高，新型的蔗糖替代品的开发和研究是功能性甜味剂领域具有重要经济价值和实际意义的当务之急。D-塔格糖是近年来发现的一种低热量的功能性单糖，D-塔格糖是一种天然存在的稀有己酮糖。它与D-半乳糖是醛酮糖异构体。D-塔格糖的甜味特性与蔗糖非常相似，甜度为蔗糖的92％，而且没有任何的不良异味或后味，可作为一种理想的风味增强剂和甜味剂；另外塔格糖还有很多特殊的功能，它可以改善肠道菌群，维护肠道健康，降低血糖，治疗糖尿病，还可以抗龋齿，是一种新型的功能性甜味剂。大量安全毒理学试验均显示，D-塔格糖安全无毒，美国食品药品管理局(FDA)于2001年批准塔格糖为公认安全食品(GRAS)，并正式批准其可作为一种甜味剂应用到食品和医药行业中。现在，D-塔格糖作为一种传统甜味剂的代用品已经被广泛地应用于烘焙食品、口香糖、饮料、巧克力、酸奶、保健以及医药产品中。

L-阿拉伯糖异构酶(EC 5.3.1.4，L-arabinose isomerase)不仅可以催化L-阿拉伯糖异构化生成L-核酮糖，也可以催化D-半乳糖异构化为D-塔格糖，被认为是目前生物法生产D-塔格糖最有效并且最可行的酶。用L-阿拉伯糖异构酶来生产D-塔格糖已经成为学者们研究的热点。目前L-阿拉伯糖异构酶的大量获得多采用大肠杆菌工程菌的过量表达方法，该方法相比较于野生微生物的产酶，具有容易控制、培养简单、发酵周期短、发酵酶活高等优点。而已有的L-阿拉伯糖异构酶大肠杆菌基因工程菌多采用乳糖操纵子重组质粒的表达方式，利用乳糖操纵子的诱导模式，以IPTG等常见诱导剂，实现L-阿拉伯糖异构酶的高效诱导表达。然而在实际操作中，蛋白表达速率过快，不易折叠成活性蛋白而形成包涵体，不利于L-阿拉伯糖异构酶的活性表达，从而影响了其发酵酶活。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的方法，该方法能够高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的活性表达，有效提高活性酶的表达量。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

一种高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的方法，其以乳糖操纵子质粒pET-22b(+)构建的L-阿拉伯糖异构酶重组菌为出发菌，利用诱导剂诱导L-阿拉伯糖异构酶的活性表达，其中，所述的诱导剂至少包括D-半乳糖。

优选地，所述诱导剂为D-半乳糖与其它诱导剂的组合。根据一个具体方面，所述诱导剂为D-半乳糖与诱导剂IPTG的组合。一般，D-半乳糖的添加浓度为0.01～10mmol/L，诱导剂IPTG的添加浓度为0.1～1mmol/L。优选地，D-半乳糖的添加浓度为0.1～1mmol/L。

根据本发明的进一步实施方案：将L-阿拉伯糖异构酶重组菌培养于LB培养基中，培养温度为37±1℃，培养至600nm光密度值为0.6时，添加诱导剂IPTG和D-半乳糖，在温度15～40℃下进行诱导，诱导时间为0.5～10h。

根据本发明，所述乳糖操纵子质粒pET-22b(+)构建的L-阿拉伯糖异构酶重组菌可以为含解纤维热酸菌L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌BL21(DE3)或含嗜热脂肪芽孢杆菌L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌BL21(DE3)。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：

本发明在L-阿拉伯糖异构酶诱导表达过程中，采用D-半乳糖作为诱导剂，有效促进了L-阿拉伯糖异构酶的折叠，从而提高了L-阿拉伯糖异构酶的活性表达，提升L-阿拉伯糖异构酶的发酵酶活，降低了L-阿拉伯糖异构酶的发酵生产成本。本发明方法所得L-阿拉伯糖异构酶，酶活性高，用于催化D-半乳糖合成D-塔格糖，可显著降低D-塔格糖的生产成本。

具体实施方式

本发明目的在于提供一种高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的方法，采用的技术方案是在以乳糖操纵子质粒pET-22b(+)构建的L-阿拉伯糖异构酶重组菌表达目的蛋白诱导表达过程中，添加酶底物D-半乳糖，促进L-阿拉伯糖异构酶的有效折叠，高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的活性表达，有效提高了活性酶的表达量，其特点是：