[发明专利]一种骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体及重组细胞有效
| 申请号： | 201210319587.3 | 申请日： | 2012-08-31 |
| 公开（公告）号： | CN102807993A | 公开（公告）日： | 2012-12-05 |
| 发明（设计）人： | 郑艳玲;张涌;权富生;王勇胜;刘军 | 申请（专利权）人： | 西北农林科技大学;杨凌科元克隆股份有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N5/10;C12N15/873 |
| 代理公司： | 西安通大专利代理有限责任公司 61200 | 代理人： | 陆万寿 |
| 地址： | 712100 *** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 骨骼肌 特异性 靶向 myostatin 基因 mirna 表达 载体 重组 细胞 | ||
1.一种骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体，其特征在于，包括MYL1启动子，在MYL1-2启动子的下游设有针对Myostatin基因进行干扰的干扰序列。
2.如权利要求1所述的骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体，其特征在于，所述的MYL1-2启动子的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；所述的干扰序列是包含有能够表达如SEQ.ID.NO.2所示的miRNA成熟体序列的片段。
3.如权利要求1或2所述的骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体，其特征在于，所述的干扰序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
4.如权利要求1所述的骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体，其特征在于，所述的MYL1-2启动子与干扰序列之间设有荧光标记筛选基因，在干扰序列的下游设有抗生素筛选基因。
5.如权利要求4所述的骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体，其特征在于，所述的抗生素筛选基因的上下游还分别设有同向的Loxp序列。
6.如权利要求4所述的骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体，其特征在于，所述的荧光标记筛选基因为EmGFP基因，抗生素筛选基因为neo基因；
EmGFP基因与neo基因之间还还设有SV40ori元件。
7.如权利要求1所述的骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体，其特征在于，所述的miRNA表达载体为pmiR-MNM2，该载体是在pcDNA6.2-GW/EmGFP载体的EmGFP下游克隆如SEQ.ID.NO.1所示的干扰序列及其互补序列形成的miR元件，在SV40ori元件下游连接pA2T载体中的Loxp-neo-Loxp片段，再在EmGFP的上游克隆MYL1-2启动子。
8.一种基于权利要求7所述的miRNA表达载体的包含靶向myostatin基因的pre-miRNA的重组细胞，其特征在于，宿主细胞为新生牛的成纤维细胞，通过转染外源性表达载体pmiR-MNM2，将目的基因靶向myostatin基因的pre-miRNA整合到新生牛的成纤维细胞的基因组。
9.如权利要求8所述的重组细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为1～3代的红安格斯新生牛成纤维细胞。
10.权利要求8所述的包含靶向myostatin基因的pre-miRNA的重组细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。
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