[发明专利]一种棉花叶片蛋白质提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学领域，尤其涉及一种棉花叶片蛋白质提取方法。

背景技术

棉花是世界上最重要的天然纤维作物,也是重要的油料作物；同时棉花也是世界性的重要的经济作物，在国民经济中占有重要的地位。棉花能制成各种规格的纺织物，这些纺织物具有穿着舒适，坚牢耐磨，能洗涤并在高温下熨烫等特点。因此，棉花具有巨大的应用价值和开发潜力。

棉花作为一种重要的经济和油料作物，在其进行大量的分子标记和QTL等研究后，对它开展蛋白质组研究就显得十分迫切，也更为可行。但棉花中含有大量的色素、酚、醌等一些次生代谢产物，严重影响所提蛋白的纯度，从而影响棉花蛋白质领域的研究，以及影响棉花产业的发展。因此，在提取蛋白质时应尽可能的除去这些物质的干扰，对解决棉花产业发展中遇到的技术问题具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种棉花叶片蛋白质提取方法，该方法提取的棉花叶片蛋白纯度高，适合后续研究工作的开展，利于促进棉花产业发展。

一种棉花叶片蛋白质提取方法，包括以下步骤：

1）取棉花叶片，用液氮研磨；

2）经液氮研磨的叶片粉末转入离心管中，并加入预冷的三氯乙酸提取液，混合均匀，放在－20℃冰箱中两小时以上，每半小时震荡一次；

3）离心管离心，弃上清，留沉淀，向沉淀中加入-20℃预冷丙酮溶液，混合均匀，于-20℃静置2～4h；

4）离心管离心，弃上清，留沉淀，洗涤沉淀，并保留沉淀；

5）沉淀抽真空，挥发丙酮，得到蛋白质干粉；

6）取干燥的蛋白粉末，加入蛋白裂解液，35℃的水浴中裂解1h，离心，取上清，所述上清为棉花叶片蛋白溶解液。

所述三氯乙酸提取液的配方为：10%TCA，0.07%-0.1%DTT，0.5％β-巯基乙醇，1mmol/L PMSF，溶剂为丙酮。

所述丙酮溶液含有0.07%-0.1%DTT和1mmol/L PMSF。

所述蛋白裂解液的配方为：7mol/L尿素,2mol/L硫脲,4%CHAPS,80mmol/L DTT,1mmol/L PMSF，0.3%载体两性电解质。

用液氮研磨叶片时加入PVPP和石英砂。

所述三氯乙酸提取液的用量是每0.4克叶片加入1.8mL预冷三氯乙酸提取液。

步骤4）所述沉淀重复洗涤3次或3次以上，或过夜洗涤，至接近白色。

所述蛋白裂解液的用量是每毫克干燥蛋白干粉加入蛋白裂解液20μl。

本发明所述棉花叶片蛋白质提取方法提取的蛋白质稳定,重复性好，且蛋白质纯度较高,电泳图谱显示几乎没有横条纹和拖尾等纹理现象,清晰，圆润。

附图说明

图1不同提取方法对棉花叶片蛋白质2-DE图谱的影响，A：酚法，B：TCA/丙酮法，C：改良的TCA/丙酮法；

图2不同上样量对棉花叶片蛋白质2-DE图谱的影响(IPGpH4-7，18cm）；

图3不同上样量对棉花叶片蛋白质2-DE图谱的影响(IPGpH4-7，24cm）。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。

本发明用到的材料：

植物材料：棉花品种“KK1543”，由新疆农业大学农学院作物遗传实验室提供。

实施例1棉花叶片获取

选取籽粒饱满且脱绒干净的棉花种子处理后放入三角瓶里，浸种24小时，待种子露白后转入放有两层滤纸的发芽盒中，并保持发芽盒湿润，待长出两片子叶后，选取长势健壮，均一的棉苗转入1/2Hoagland培养液中，人工气候室水培。培养条件为温度为28/25C(白天/晚上)，光强为12000lx以上光照350～400，每天光照10小时，相对湿度为60～80%。每隔4d换一次培养液,并注意清洗根部和盆子等处的青苔，培养半个月后取其叶片，用纯水，去离子水依次清洗干净，用滤纸吸干水后，于液氮中速冻后置于-80℃超低温冰箱保存，待用。

本实施例所用棉花为KK1543。

实施例2棉花叶片蛋白提取