[发明专利]螺旋藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及螺旋藻深加工及生物技术领域，具体涉及螺旋藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法。

背景技术

螺旋藻(Spirulina platensis)是一种蓝藻,具有护肝,抗氧化,防病毒,抗癌和增强免疫力等生理功能. 螺旋藻蛋白质占其干重的50-70%,是迄今发现的蛋白质含量最高的物种之一. 螺旋藻蛋白质组成最接近于世界粮农组织(FAO) 规定的标准,包含18种氨基酸,并具有人体必须的全部8种氨基酸,是一种优质蛋白源. 目前，螺旋藻主要以干粉和片剂形式使用。由于其溶解性有限，不利于人体直接吸收等问题，使其应用受到一定的限制。因此，从螺旋藻中分离纯化活性肽具有巨大的社会经济效益和广泛的应用前景。

生物活性肽是指对生物机体的生命活动有益或具有生物活性的氨基酸聚合物，又称为功能肽。其结构松散，小至由两个氨基酸大到由数百个氨基酸通过肽键连接而成。现代营养学表明，蛋白质经消化道酶作用后并不一定以完全游离氨基酸的形式吸收，且主要是低肽的形式吸收，具有更高的营养价值和生物效价。酶水解法获得生物活性肽已经成为工业化生产生物活性肽的主要手段。

恶性肿瘤已经成为我国居民死亡的首要原因之一。目前对肿瘤患者的治疗方法主要是化疗和放疗手段，对人体损伤严重。几十年来，人们一直在探索对人体损伤小治疗肿瘤方法，大多从天然动植物中寻找活性高、毒副作用小的广谱抗肿瘤新药。迄今为止，发现多种生物活性肽具有抗肿瘤活性，抗肿瘤肽因其分子量小、肿瘤细胞穿透能力强、提高免疫应答、抑制肿瘤血管形成等特点，已经成为肿瘤治疗研究的热点。

壳聚糖无毒，具有良好的生物相容性、可降解性、成膜性和可塑性.壳聚糖还具有一定的抗菌、抗肿瘤、抗病毒活性。因此，壳聚糖的应用日益受到人们的重视，在食品和生物医药领域具有广阔的前景。特别对于生物活性肽, 壳聚糖包埋可望提高其稳定性和生物利用度，达到更好的营养功能和生理功效。

发明内容

为拓展螺旋藻在食品和生物医学领域的应用，本发明提供螺旋藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法。

本发明的目的通过以下方案来实现:

螺旋藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，具体包括如下步骤： 

（1）取螺旋藻粉溶于Milli-Q水中，常温下磁力搅拌，待其全部溶解后置于冰箱中冷冻中，再置于冰箱中解冻，如此反复冻融三次，然后，采用超声破碎方法，将螺旋藻壁破碎，使得蛋白质游离出来，将蛋白质置于冰浴中，最后，将获得的溶液离心，去除沉淀获得蛋白上清液, 再真空冷冻干燥，获得螺旋藻蛋白质粉；

（2）以步骤（1）得到的螺旋藻蛋白质粉为基础, 配置质量浓度为1~5%的螺旋藻蛋白水溶液，加入水解酶进行水解，水解后，灭酶，冷却至室温后将水解液离心，取上清液，然后,经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤，滤液再经过5 KD、10 KD的超滤离心管过滤，即可获得分子量大小范围为<5 KD、5-10 KD、>10 KD的螺旋藻多肽水解液；

(3) 以步骤（2）得到的5-10 KD的螺旋藻多肽水解液为基础, 使用葡聚糖凝胶Sephadex G-50分离纯化，并且按照出峰顺序共收集到三个峰，分别为第一个峰Y1，第二个峰Y2，第三个峰Y3；

(4) 以步骤（3）得到的纯化的螺旋藻多肽水解液Y2为基础,再采用三聚磷酸钠（TPP）离子交联法即可得到螺旋藻多肽-壳聚糖纳米粒Y2-CS。

上述的螺旋藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，步骤（1）所述螺旋藻粉为5~50 g；所述Milli-Q水为100~1000 mL；所述磁力搅拌的时间为10~60 min。

上述的螺旋藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，步骤（1）所述冷冻为在-20 ℃冰箱中冷冻80 min；所述解冻为在4 ℃冰箱中解冻。

上述的螺旋藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，步骤（1）所述超声破碎方法为在10~300 W的超声功率下超声，每超声5~20 s间隔3~10 s,共超声10~300次。

上述的螺旋藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，步骤（1）所述离心为在温度4 ℃,转速为5000~10000 r/min下离心10~60 min。

上述的螺旋藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，步骤（2）所述水解酶为胰蛋白酶；所述水解为在温度30~50 ℃，pH= 5~10，酶与螺旋藻蛋白质水溶液的比1%~5%（w/v，g/mL）下水解, 水解时间5~15h。