[发明专利]运动机能相关基因CKMM荧光检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种运动机能相关基因CKMM荧光检测试剂盒及检测方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

随着人类基因组计划的完成，后基因组计划的全面展开，以基因工程为主导的生物技术在体育运动问题领域的应用得到广泛的关注。基因遗传工程应用于运动员选材是历史必然、大势所趋，它必将从根本上引起运动选材理论和方法的革命。运用遗传学的理论和方法进行运动选材已经有了初步进展。

肌酸激酶(CK)是Cr+MgATP+H—PCr+MgADP反应的关键酶。CK与磷酸肌酸组成肌酸一磷酸肌酸穿梭系统，在细胞内的作用：一是，在高能量需求时作为“暂时的能量缓冲系统”保持ATP／ADP的比率；二是，作为能量转运单位，将能量从产生部位转运到利用部位。肌型肌酸激酶是一种组织特异性酶，主要在骨骼肌中表达，心肌中也有少量表达。肌肉中CKMM主要集中在M线附近，其主要功能是在肌球蛋白头部生成高浓度的ATP，为肌肉收缩及运动提供能量，CKMM也存在肌质网Ca ATP酶附近，可能影响Ca的再聚集，从而影响肌肉的工作能力。研究表明，人的CKMM基因的多态性与耐力以及耐力训练效果有关。

CKMM基因多态性的三种基因型分别为:AA型、GG型和杂合子AG型。研究结果显示：与耐力训练前相比，训练后相通亚极限强度运动时，AA、AG型的人运动能力提高显著，但GG型训练后各种指标改变不明显。因此GG型基因为耐力训练中最不敏感，携带A等位基因的AA型、AG型人对耐力训练的敏感性显著高于和GG型。

最新研究表明在高强度运动后出现的肌痛、肌酸激酶增高等横纹肌溶解症状，与ACE与CKMM基因有密切的关系。运动后与D等位基因（ACE基因）和G等位基因（CKMM基因）的个体更易出现肌酸激酶高反应。而同时具有DD基因型（ACE基因）和GG基因型（CKMM基因）的人，会出现运动后肌酸激酶异常升高，D+G基因型有相加作用。

目前常用的基因检测方法有：直接测序（direct sequencing,DS）、连接酶检测反应（ligase detection reaction，LDR）、限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC）、定量PCR。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。

采用荧光标记技术、毛细管电泳技术，通过带不同荧光标记物的引物对运动机能相关基因CKMM特异性的扩增，而后经毛细管电泳后分析PCR产物出峰情况，即可实现对该运动机能相关基因位点的检测，灵敏度高、判读清晰准确、采样方便。

发明内容

本发明的目的是提供一种运动机能相关基因CKMM荧光检测试剂盒及检测方法。

本发明所述的检测运动机能相关基因CKMM荧光检测试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂；

所述扩增前试剂包括：PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs的混合物，Taq酶，引物混合物以及超纯水；

所述扩增后试剂包括：内标和用于基因分型的基因分型标准物；

使用所述的试剂盒进行PCR扩增反应的条件：PCR扩增体系的pH值为8.0-9.0，镁离子浓度为1.5-3.5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300μM，Taq酶的用量为0.1-0.4U/μL，引物终浓度为0.2-0.4μM。

用于CKMM基因检测的引物为：

SEQ NO.1：5’-AGG GTG TCA GGT GTG AAA GAA TCA-3’；

SEQ NO.2：5’-GTATCCT TAC TTT CTC AAG AAC CTG CCG-3’；

SEQ NO.3：5’-CCT TAC TTT CTC AAG AAC CTG CCA-3’。

所述的引物中SEQ NO.1的5’端进行荧光染料标记，内标所用的荧光染料为不同的荧光素。

所述扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。

采用所述试剂盒应用于运动机能相关基因检测的方法，是通过荧光引物PCR及毛细管电泳特异性检测运动机能相关基因CKMM；用于CKMM检测的引物为：SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3，所述基因的扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。