[发明专利]叶黄素二琥珀酸酯的液质联用检测方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种叶黄素二琥珀酸酯的液质联用测定方法，可用于监测叶黄素和琥珀酸合成反应进程及检测反应产物。 

二、背景技术

叶黄素(1utein)是一种含羟基的类胡萝卜素，具有抗氧化作用，能预防老年性黄斑退化，延缓早期动脉硬化进程。Phyllis E.Bowen等在健康被试者的饮食中分别加入相同剂量的叶黄素酯和叶黄素，以血浆中叶黄素的浓度×时间(AUC)为衡量生物利用度的指标，结果表明叶黄素酯的AUC比叶黄素大61.6％。琥珀酸是一种内源性神经活性调节物质，具有抗惊厥、抗癫痫、镇静、降温、镇痛等作用。琥珀酸是三羧酸循环的中间代谢物，位于三羧酸循环及脑内特有的谷氨酸-γ-氨基丁酸-琥珀酸代谢旁路的枢纽地位，不仅参与能量代谢，也影响兴奋性谷氨酸和抑制性γ-氨基丁酸神经递质平衡。将叶黄素与琥珀酸酐酯化合成叶黄素二琥珀酸酯可以提高叶黄素的生物利用率，同时满足人们对于琥珀酸的需求。 

液质联用(HPLC-MS)技术是以高效液相色谱色谱为分离手段，以质谱为鉴定工具的一种分离分析技术，具有液相色谱的高效分离能力和质谱的高灵敏度、极强的定性专属特异性。尚未见HPLC-MS用于叶黄素二琥珀酸酯的定性定量分析的报道。因此，建立高效的叶黄素二琥珀酸酯定性及定量分析方法用于监测叶黄素二琥珀酸酯的合成反应及其进一步应用具有重要作用。 

三、发明内容

本发明的目的是提供一种快速、准确的叶黄素二琥珀酸酯的液质联用测定方法，该项技术不仅可以对合成的叶黄素二琥珀酸酯进行准确的定性分析，还可以进行定量分析。 

本发明包括下列步骤： 

1、叶黄素二琥珀酸酯的HPLC(分析型)检测 

取20μL合成的叶黄素琥珀酸酯样液进行HPLC检测，HPLC条件为色谱柱YMC Carotenoid C30(4.6mm×250mm，5μm)，流动相0.05％乙酸甲醇溶液与0.05％乙酸乙腈溶液的体积比为50∶50，时间30min，流速1.0mL/min，DAD检测器，柱温25℃，进样量20μL，检测波长450nm。 

2、叶黄素二琥珀酸酯的质谱检测 

采用大气压化学电离源，正离子扫描模式，色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为 10μL/min，扫描范围m/z50-1200，气化温度350℃，毛细管电压4500V，干燥气体流速4L/min，雾化器压力20psi。 

3、建立叶黄素二琥珀酸酯标准曲线 

准确称取5mg叶黄素二琥珀酸酯标准品，用乙腈溶解并定容至10mL，混匀，制成浓度为500μg/mL的标准液。再分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL标准液置于5mL容量瓶中，用乙腈定容并混匀，制成浓度为10、20、30、40、50μg/mL的系列标准液，按照上述的C30-HPLC色谱条件测定，以进样量为横坐标，相应的吸收峰面积为纵坐标，进行线性回归分析。 

有益效果 

1、本发明采用C₃₀-HPLC将合成的叶黄素琥珀酸酯与叶黄素分离，在流动相中加入少量的乙酸，一方面可以改善色谱峰型，另一方面保持叶黄素琥珀酸酯的质子化，保证质谱的响应信号。反应0h，采用C₃₀-HPLC测定反应样液，在21.916min得到一个色谱峰，如图1A所示；当反应6h，测得的色谱图如图1B所示，分别在17.289min、19.166min、21.320min得到三个峰，峰3的保留时间(21.320min)与图1A中叶黄素的保留时间(21.916)一致，所以峰3为叶黄素。将图1B与图1C(反应12h后样液的色谱图)比较，结合光谱和极性分析，初步判断峰1为叶黄素二琥珀酸酯，峰2为叶黄素单琥珀酸酯。 

2、本发明对反应了6h的样品进行了正离子模式的LC-APCI-MS分析，以此确定图1B中各个峰的归属。LC-APCI-MS检测结果如图2至图4所示，对响应较强的三个峰进行了质谱分析，它们均具有叶黄素和叶黄素酯的特征吸收，分析结果见表1，由此确定峰1为叶黄素二琥珀酸酯，峰2为叶黄素单琥珀酸酯，峰3为叶黄素。 

表1叶黄素及其琥珀酸酯的LC-APCI-MS分析结果