[发明专利]发酵阿拉伯糖的真核细胞的代谢工程改造

说明书

本发明涉及发酵阿拉伯糖的真核细胞的代谢工程改造。具体地，本发明涉及表达下述多核苷酸序列的真核细胞，所述序列编码ara A、ara B和ara D酶，从而这些核苷酸序列的表达赋予细胞使用L‑阿拉伯糖和/或将L‑阿拉伯糖转化为L‑核酮糖和/或5‑磷酸木酮糖和/或转化为期望的发酵产物如乙醇的能力。任选地，该真核细胞还能够将木糖转化为乙醇。

本申请是中国发明专利申请200780036866.6(PCT/NL2007/000246)的分案申请，母案申请日为2007年10月1日，题目为“发酵阿拉伯糖的真核细胞的代谢工程改造”。

发明领域

本发明涉及下述真核细胞和使用该细胞生产发酵产物的工艺，所述细胞具有使用L-阿拉伯糖和/或将L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖和/或转化为期望的发酵产物的能力。

发明背景

乙醇染料被认为是化石燃料的有价值的备选方案。从植物生物质的半纤维素级分到乙醇的经济学可行的生产需要以相当的速率和高产率同时发酵转化戊糖和己糖这二者。酵母(尤其是Saccharomyces spp.)是该工艺的最适当的候选者，因为在需氧和厌氧时它们均能够在己糖上快速生长和发酵。另外，它们对木质纤维素水解产物的毒性环境比(经一般修饰的)细菌有抗性得多。

EP 1499708描述了制造下述S.cerevisiae菌株的工艺，所述菌株能够从L-阿拉伯糖生产乙醇。通过引入Bacillus subtilis的araA(L-阿拉伯糖异构酶、来自Escherichiacoli的araB(L-核酮糖激酶)和araD(L-核酮糖-5-P4-差向异构酶)基因来修饰这些菌株。另外，这些菌株基因组中带有额外的突变，或者过表达TAL1(转醛酶)基因。然而，这些基因具有若干缺点。它们在氧受限的条件下发酵阿拉伯糖。另外，它们具有0.05g.g-1.h-1的低乙醇生产速率(Becker and Boles，2003)。另外，这些菌株不能够在厌氧条件下使用L-阿拉伯糖。最后，这些S.cerevisiae菌株具有野生型背景，因此它们不能被用于共同发酵若干种C5糖。

WO 03/062430和WO 06/009434公开了能够将木糖转化为乙醇的酵母菌株。这些酵母菌株能够值直接将木糖异构化为木酮糖。

仍然存在对生产乙醇的下述备选菌株的需要，所述菌株运行更好，并且更有活力和对相对苛刻的生产条件更具抗性。

附图说明

图1：pRW231和pRW243的质粒图谱。

图2：在含0.5％半乳糖(A)和0.1％半乳糖+2％ L-阿拉伯糖(B)的合成培养基中，菌株RWB219(○)和IMS0001(●)摇瓶培养的生长模式。培养物在含半乳糖(A)的合成培养基中培养72小时，然后被转移至含半乳糖和阿拉伯糖(B)的合成培养基。通过测量OD660来测定生长。

图3.S.cerevisiae IMS0001在摇瓶培养物中系列转移期间的生长速率，所述培养物含有含2％(w/v)L-阿拉伯糖的合成培养基。每个数据点代表从(指数)生长期间测量的OD660评价的生长速率。闭合和开放的圆圈代表一式两份的系列转移实验。

图4.S.cerevisiae IMS0001在含2％(w/v)L-阿拉伯糖的合成培养基中厌氧SBR发酵期间的生长速率。每个数据点代表从指数生长期间的CO2谱(实线)评价的生长速率。